יצירת נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

קח מיקרו-צלחת מצופה מטריצה חוץ-תאית והוסף תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים תלויים בתווך התמיינות.

המדיום מכיל מולקולות איתות המשפיעות על מסלולי איתות תאיים, ומכוונות את ההתמיינות לתאי אב עצביים.

הכנס מדיום התמיינות נוסף המכיל מולקולות איתות הגורמות להתמיינות לתאי פסגה עצבית, או NCCs, קודמים לתאים עצביים ולא עצביים.

הוסף אנזימים כדי לשבש את המטריצה, ובכך להפריד את התאים.

שטפו כדי לנטרל את האנזימים, ואז צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את ה-NCCs בתווך ספרואיד והעבירו אותם למיקרו-פלטה.

גורמי הגדילה והמולקולות הקטנות של המדיום גורמים להיווצרות ספרואידים.

תוסף עם חומצה רטינואית, המעודדת התמיינות לתאי עצב אב סימפתטיים.

העבירו את הספרואיד על מיקרו-לוחית מצופה חלבון הידבקות במדיום התבגרות של נוירונים סימפתטיים, מה שגורם להתקשרות ספרואידית.

גורמי גדילה עצביים וחומצה רטינואית במדיום מקדמים התבגרות לנוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים, המהווים חלק ממערכת העצבים ההיקפית ומווסתים תהליכים לא רצוניים.

יום אחד לפני אינדוקציה של התמיינות, מצפים את המספר המתאים של צלחות שש בארות בשני מיליליטר מטריצת קרום מרתף לבאר, ומאחסנים את הלוחות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, חממו את הצלחות לטמפרטורת החדר, ושטפו את תרבית תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים המוכנים לפיצול פעמיים עם PBS טרי לכל שטיפה.

לאחר השטיפה השנייה, טפל בתאים בשבעה מיליליטר של 0.5 מילי-מולרי EDTA במשך 15 דקות באינקובטור תרבית התאים, לפני שאיבת תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים הצפים והעברת התאים שנקטפו לצינור של 50 מיליליטר.

הוסף נפח שווה של PBS לצינור כדי לדלל את ה-EDTA, ואסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום התמיינות יום 01. לפני הוספת נפח מתאים של מדיום לספירה, יש לדלל את התאים לריכוז של 1.25 x 10⁵ תאים לסנטימטר רבוע בשני מיליליטר של מדיום התמיינות לבאר.

שאפו את כל תמיסת מטריצת קרום המרתף מכל באר של צלחת שש הבארות שהוכנה בעבר. לאחר מכן, זרעו 2 מיליליטר תאים לכל באר, והניחו את הצלחת בחממת תרבית התאים. למחרת בבוקר, האכילו את התאים ב-3 מיליליטר של מדיום התמיינות יום 01 לכל באר.

ביום השני של ההתמיינות, האכילו את התאים בשלושה מיליליטר של יום שני עד עשרה מדיום התמיינות לכל באר. לאחר מכן, האכילו את התאים כל יומיים עד היום העשירי. כדי לצבור את תאי הפסגה העצבית לספרואידים, ביום 10, שטפו את התאים עם PBS, והוסיפו שני מיליליטר של מדיום דיסוציאציה לכל באר. לאחר 20 דקות בחממת תרבית התאים, העבירו את התאים הצפים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר, והביאו את נפח ההשעיה בצינור ל -50 מיליליטר עם PBS טרי.

אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, והשהה מחדש את הכדור בנפח מספיק של יום 10 עד 14 מדיום ספרואיד לספירה. לאחר הספירה, יש לדלל את התאים ל-5 x 10⁵ תאים לריכוז של 500 מיקרוליטר באמצעות מדיום ספרואיד ביום 10 עד 14, ולצלחת 500 מיקרוליטר של תאים לכל באר של צלחת 24 בארות מצורפת נמוכה במיוחד. לאחר מכן החזר את התאים לחממת תרבית התאים.

כדי לגרום לתרבית ספרואידית מינימלית, ביום ה-11 של התרבית, הזינו את ספרואידים של הפסגה העצבית ב-500 מיקרוליטר נוספים של יום 10 עד 14 מדיום ספרואיד לבאר. ביום ה -12, הטה את הצלחת כדי לצבור את הכדורים בצד אחד של הצלחת, ושאף בזהירות כמה שיותר מדיום מכל באר מבלי לשאוב ספרואידים. לאחר מכן, האכילו את הספרואידים במיליליטר אחד של יום 10 עד 14 מדיום ספרואיד לבאר.

כדי לגרום לתרבית ספרואידית מורחבת ביום ה-15, האכילו את הספרואידים ב-1.5 מיליליטר של מדיום ספרואיד ביום 10 עד 14 בתוספת 0.5 חומצה רטינואית מיקרו-מולרית לבאר. לאחר מכן, החזירו את הספרואידים לחממת תרבית התאים.

לצורך התמיינות נוירונים סימפתטיים ביום 14 או 28, הטה את הצלחת כדי לצבור את הספרואידים בצד אחד של הצלחת, ושאף בזהירות כמה שיותר מדיום. הזינו את התאים במיליליטר אחד של מדיום נוירון סימפתטי.

כדי לפרק אגרגטים ספרואידים גדולים לספרואידים קטנים יותר, הוסף לא יותר ממיליליטר אחד של מדיום לבאר, ופיפטה את הספרואידים חמש עד 10 פעמים לפני הפיצול.

והסר את עודפי הפיברונקטין של הלמינין מצלחות 24 בארות שהוכנו בעבר. פצלו את הצלחת מיליליטר אחד של ספרואידים מכל באר על צלחת התרבית הספרואידית בת 24 הבארות בין ארבע בארות נפרדות של צלחת 24 הבארות המצופה החדשה. הוסף 250 מיקרוליטר של מדיום נוירונים סימפתטי טרי לכל באר, והניח את הצלחת בחממת תרבית התאים. למחרת בבוקר, החלף את המדיום בכל באר במיליליטר אחד של מדיום נוירונים סימפתטי בתוספת 0.125 חומצה רטינואית מיקרו-מולרית והחזיר את הצלחת לחממת תרבית התאים. לאחר יום 35, האכילו את הנוירונים על ידי החלפה בזהירות של מחצית מהמדיום הקיים בכל באר במדיום טרי.