JoVE Encyclopedia of Experiments
מדעי המוח
0 צפיות • 3:14 דק' • July 8th, 2025
קחו תרבית של תאי אב עצביים אנושיים, או NPCs, הנתמכים על מטריצה חוץ-תאית.
ה-NPCs מתוכננים לבטא חלבון פלואורסצנטי.
השליכו את המדיום ושטפו את התאים כדי להסיר את כל המדיום שנותר.
דגרו את התרבות עם אנזימים המשבשים את המטריצה, ומפרקים את התאים.
העבירו את התאים המנותקים לצינור והוסיפו מדיום לנטרול הפעולה האנזימטית.
צנטריפוגה כדי לגלול את התאים, להשליך את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את ה-NPCs בתווך התמיינות עצבי.
העבירו את ה-NPCs לתרבית משותפת מבוססת של אסטרוציטים של עכברים ונוירונים בקליפת המוח של חולדות.
גורמי גדילה המשתחררים על ידי התרבות המשותפת המבוססת, יחד עם מגעי התא-תא של ה-NPCs עם הנוירונים והאסטרוציטים בקליפת המוח, מקדמים התמיינות של ה-NPCs לנוירונים בוגרים.
הנוירונים הבוגרים מציגים תהליכים תאיים מורחבים ויוצרים קשרים סינפטיים.
תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, השתמש באות מהחלבונים הפלואורסצנטיים כדי לדמיין את הנוירונים האנושיים שמקורם ב-NPC.
לאחר יצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים או iPSCs, יש להשרות ולתחזק את התאים כתא אב עצבי אנושי או תרבית NPC על פי פרוטוקול הטקסט. בדוגמה זו, ה-NPCs מסומנים באמצעות הווקטור ה-lentiviral Synapsin1-tdTomato. יום לאחר הוספת נוירונים ראשוניים לתרבית אסטרוציטים, השתמשו ב-1X PBS כדי לשטוף NPCs אנושיים פעם אחת. לאחר מכן, הוסיפו תמיסת ניתוק תאים ודגרו במשך חמש דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.
ודא שכל התאים התנתקו, לאחר מכן, העביר אותם לצינור של 15 מיליליטר המכיל כמות כפולה של DMEM/F12 וצנטריפוגה ב-200 גרם למשך חמש דקות. הסר את הסופרנטנט והשתמש במדיום התמיינות עצבי כדי להשעות בעדינות את הגלולה לתאים בודדים. השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים.
לאחר מכן, שאפו בזהירות את המדיום מתרביות הנוירונים בקליפת המוח של האסטרוציטים. צלחו את ה-NPCs האנושיים ב-5,000 תאים לסנטימטר רבוע לבאר במדיום התמיינות עצבי. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 והחלפת המדיום כל יומיים-שלושה למשך 28 ימים לפחות.
כדי לוודא אם iPSCs אנושיים מתנהגים כמו נוירונים בוגרים, השתמשו במיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בעדשת טבילה במים פי 60. למצוא תאים מובחנים מ-iPSCs אנושיים על ידי הדמיה של tdTomato.