יצירת אורגנואידים מוחיים פלוריפוטנטיים המושרים שמקורם בתאי גזע

קחו מושבות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, או iPSCs, שגודלו על מטריצה תומכת.

הוסף תמיסה המכילה אנזימים כדי לפרק את המושבות לתאים בודדים.

העבירו את התאים לתוך צינור, צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט.

להשעות מחדש את תאי ה-iPSC במצע גידול.

העבירו את התאים למיקרו-פלטה המכילה סיבי פולימר תואמים ביולוגית.

צנטריפוגה לאגרגציה של iPSCs, ויוצרת גופים עובריים, או EBs, על פיגום הפולימר.

מעבר למדיום אינדוקציה עצבית המקדם התפשטות והתמיינות iPSC לתאי גזע עצביים, תאי אב ונוירונים לא בשלים.

עם הדגירה, התאים עוברים ארגון עצמי.

הניחו את הגופים העובריים על יריעה עם גומות והוסיפו טיפות המכילות חלבוני מטריצה חוץ-תאיים.

דגירה כדי למצק את המטריצה, להטמיע את ה- EBs.

העבירו את ה-EBs למיקרו-פלטה המכילה מדיום תחזוקה עצבי. דגירה.

ה-EBs עוברים התפשטות תאית ליצירת בליטות וניצנים ומתמיינים לנוירונים בוגרים, ויוצרים אורגנואידים מוחיים.

שאפו את המדיום בעזרת פיפטה, ושטפו את התאים פעם אחת עם DPBS. לאחר מכן, הוסיפו 500 מיקרוליטר של תמיסת ניתוק תאים, או 0.5 מילי-מולרי EDTA, כדי לנתק את המושבות, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 עד 5 דקות. לאחר מכן, הוסף 1 מיליליטר של מדיה E8 טרייה לכל באר, ופיפטה בעדינות כדי לנתק את כל התאים.

העבירו את כל מתלה התא לצינור צנטריפוגה של 15 מילימטר, והוסיפו עוד 1 מיליליטר של מדיה E8 טרייה. לאחר מכן, סובב את התאים ב -290 גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר השלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את כדור התא ב-1 מיליליטר של מדיה E6, בתוספת מעכב ROCK מיקרו-מולרי 50, וספרו את התאים באמצעות המוציטומטר.

הכן מתלה תאים בצפיפות הישיבה הרצויה במדיית E6, בתוספת מעכב ROCK. לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטר של מתלה התא לכל באר של לוחית חיבור נמוכה במיוחד של 96 בארות.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הצלחת ב -290 גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר כדי לצבור את התאים בכוח. לאחר מכן, דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה עם 5% פחמן דו חמצני להיווצרות גוף עוברי.

לאחר 24 שעות של דגירה, העבירו את הצלחת למכסה המנוע, ושאבו בזהירות 120 מיקרוליטר מהמדיה באמצעות פיפטה, תוך הקפדה לא לשאוב את הגוף העוברי על ידי הורדת קצה הפיפטה עמוק מדי לבאר.

לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטר של מדיה E6 טרייה, בתוספת 2 מיקרו-מולרי XAV939 ומעכבי SMAD לכל באר. העבירו את הצלחת חזרה לחממה, והחליפו את המדיום מדי יום ב- E6 טרי שהוכן בתוספת המעכבים.

ביום השביעי של הדגירה, בדקו אם כל הגופים העובריים הגיעו לקוטר של 550 עד 600 מיקרומטר והציגו קצה חלק וברור. בשלב זה, הם מוכנים להטמעה במטריצה חוץ-תאית.

כדי להטמיע את האורגנואידים, הכינו יריעות הטבעה עם גומות על ידי הנחת יריעת סרט איטום תרמופלסטית באורך 4 אינץ' על קופסת P200 ריקה. לאחר מכן השתמש בצינור חרוטי של 15 מיליליטר, או בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 500 מיקרוליטר, ולחץ בעדינות כלפי מטה את יריעת הסרט לתוך החורים כדי ליצור 12, או את המספר הרצוי של גומות.

לאחר מכן, רססו 70% אתנול על יריעת הסרט, ותנו לו להתייבש בתוך מכסה המנוע כשנורית ה-UV דולקת למשך 30 דקות לפחות. בינתיים, הפשירו כמות מספקת של מטריצת קרום הבסיס על קרח. לאחר מכן, באמצעות קצה P200 רחב קדח, העבירו גוף עוברי אחד מצלחת 96 הבארות לכל גומה. הסר כמה שיותר מדיה עם קצה פיפטה רגיל, אך אל תתנו לגוף העוברי להתייבש.

לאחר מכן, עם קצה P200 רגיל מקורר מראש, הוסף כ-30 מיקרוליטר של מטריצת ממברנה לא מדוללת לכל אורגנואיד, וודא שהגוף העוברי קרוב ככל האפשר למרכז הטיפה.

לאחר שכל הגופים העובריים מוטבעים במטריצה, הניחו את יריעת הסרט בצלחת פטרי סטרילית. לאחר מכן דגרו את צלחת הפטרי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות באווירה לחה עם 5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר למטריצת הממברנה להתמצק.

להתמיינות אורגנואידית, הוסף 5 מיליליטר מאמצעי הבידול המוכנים עם B27 ללא ויטמין A לבאר אחת של צלחת 6 בארות חיבור נמוכה במיוחד. מחממים מראש את הצלחת ל -37 מעלות צלזיוס בחממה. לאחר שמטריצת הממברנה התמצקה, העבירו את הגופים העובריים המוטבעים לצלחת 6 הבארות על ידי דחיפת הגומות מהחלק האחורי של יריעת הסרט. במידת הצורך, השתמש במיליליטר אחד של מדיה מהבאר, והניח אותה על הסדין כדי לנתק את הטיפות מגיליון הסרט.