טכניקה עקיפה של תרבית נוירון-אסטרוציטים לחקר אינטראקציות נוירון-גליה

התחל עם צלחת מרובת בארות המכילה תוספת קרום חדירה המצופה בפולי-D-ליזין.

הוסף מצע גידול אסטרוציטים לבאר וזרע אסטרוציטים, תא גליה מיוחד, לתוך התוספת.

דגירה כדי לאפשר היצמדות תאים לפולי-D-ליזין באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות וליצור שכבה חד-שכבתית.

החלף את מדיום האסטרוציטים במדיום תרבית נוירונים.

העבירו את התוספת הזו לצלחת מרובת בארות המכילה נוירונים עובריים ראשוניים של עכבר דבוקים מעל כיסוי מצופה פולימר.

דגירה כדי ליצור קו-תרבית עקיפה של נוירון-אסטרוציטים, שבה שני סוגי התאים מופרדים פיזית אך חולקים את אותו מדיום תרבית.

אסטרוציטים מפרישים גורמים נוירוטרופיים שונים החיוניים להישרדות ולצמיחה של תאי עצב.

גורמים אלה נודדים דרך התמיכה החדירה ומקיימים אינטראקציה עם נוירונים ראשוניים. זה מקדם את הבידול שלהם ויוצר הקרנות עצביות.

הקרנות אלה מאריכות ויוצרות קשרים סינפטיים בין נוירונים, מה שמעיד על אינטראקציות נוירוניות-גליאליות.

מצפים כל תוספת ב-10 מיקרוגרם למיליליטר פולי-D-ליזין ודוגרים למשך שעה. לאחר שעה יש לשטוף את התוספות פעמיים עם PBS.

בינתיים, שאפו את מדיום האסטרוציטים ושטפו את התרבית פעם אחת עם 10 מיליליטר PBS כדי להבטיח הסרת שאריות סרום. לאחר מכן, הוסיפו 3 מיליליטר של 0.05% טריפסין EDTA לצלוחיות ודגרו על התאים לטריפסיניזציה למשך כ-10 דקות. לאחר מכן, השעו בעדינות את התאים ב-7 מיליליטר של מדיום אסטרוציטים.

העבירו את תרחיף התא לצינור של 15 מיליליטר, וצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-216 פעמים גרם. לאחר מכן, שאפו בזהירות את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב-1 מיליליטר של מדיום אסטרוציטים. ספרו את התאים באמצעות תא ספירה. לאחר מכן, מלאו את צלחת 24 הבארות ב -500 מיקרוליטר מדיום אסטרוציטים לבאר. שאפו את ה-PBS והעבירו 25,000 תאים ב-500 מיקרוליטר של מדיום אסטרוציטים לכל תוספת בודדת, ודגרו על התרבית ב-37 מעלות צלזיוס.

כדי לנתח את ההיפוקמפוס, הכינו שלוש מנות של 10 סנטימטר מלאות במדיום הכנה וצינור אחד של 2 מיליליטר עם 1 מיליליטר של מדיום הכנה. נתח את ההיפוקמפוס מחלקי קליפת המוח ואסוף אותם בצינור של 2 מיליליטר מלא במדיום הכנה.

זה קריטי שההיפוקמפוס יהיה מבודד ללא כל רקמה סמוכה מאזורים אחרים של מערכת העצבים המרכזית. לכן, לאחר הסרת ההיפוקמפוס, יש להסיר בנוסף את הרקמות המזהמות הזרות.

לאחר הדיסקציה, העבירו את הצינור לספסל זרימה למינרי סטרילי. הסר את מדיום התכשיר בזהירות, ועכל את רקמת ההיפוקמפוס עם 1 מיליליטר תמיסת עיכול המכילה פפאין. לאחר 15 דקות של עיכול, משוך בזהירות את תמיסת העיכול על ידי יניקה עדינה עם פיפטה.

בשל הרגישות הגבוהה של הנוירון, קריטי לשלש את ההיפוקמפוס בזהירות על מנת למנוע בועות ולהשיג את עוצמת הטריטורציה האופטימלית.

שטפו את ההיפוקמפוס שלוש פעמים עם מדיום נוירונים על ידי הוספה ושאיבה בזהירות של 1 מיליליטר של מדיום תרבית טרי לכל מחזור כביסה. לאחר שלב הכביסה האחרון, יש לשלש בזהירות את הרקמה במיליליטר אחד של מדיום נוירונים. לאחר מכן, ספרו את התאים באמצעות תא ספירה. צלחת 35,000 תאים ב-500 מיקרוליטר של תווך נוירונים לכל באר של צלחת 24 הבארות, ודגירה על הנוירונים ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

כעת, הוציאו מהאינקובטור את התוספות המוכנות, שנזרעו בחד-שכבות אסטרוציטים קונפלוגנטיות. החלף את המדיום על ידי שאיבת תווך האסטרוציטים והחלפתו ב-500 מיקרוליטר של תווך נוירונים טרי.

לאחר מכן, הניחו את התוספות עם אסטרוציטים בזהירות לתוך הבארות המכילות את תרביות הנוירונים באמצעות מלקחיים סטריליים. לאחר מכן, הנח את התרבות המשותפת של אסטרוציטים נוירונים עקיפים שנוצרה בחזרה לתוך החממה עד לניסויים.