בידוד תאי מיקרוגליה מקליפת המוח של מוח עכבר בוגר

קחו למשל קליפת מוח של עכבר שזה עתה נקטף.

קוצצים את הרקמה לשברים קטנים. העבירו אותם להומוגנייזר צונן המכיל מאגר עם מעכבי RNase ו-DNases.

הומוגניזציה אופטימלית של הרקמה כדי לשחרר תאים לתרחיף, תוך שמירה סלקטיבית על מיקרוגליה בשל יכולתם לעמוד בכוחות גזירה ולשמור על כדאיות הממברנה, תוך סילוק נוירונים ותאי גליה אחרים.

יתר על כן, מעכבי RNase מפרקים RNases, בעוד ש-DNases מפרקים כל DNA מזהם.

העבירו את תרחיף התאים דרך מסננת תאים כדי להסיר פסולת רקמות.

העבר את מתלה התא לצינור. צנטריפוגה והסר את האנזימים המכילים סופרנטנט. השעו מחדש את התאים במאגר.

הוסף מיקרו-חרוזים מגנטיים נגד מיאלין. מיקרו-חרוזים אלה מכוונים לחלבון המיאלין, קושרים פסולת מיאלין ואוליגודנדרוציטים.

טען את תערובת חרוזי התא לעמודת דלדול הכוללת מטריצה עם כדורים פרומגנטיים.

תחת השדה המגנטי המופעל, פסולת המיאלין והאוליגודנדרוציטים הקשורים למיקרו-חרוזים נשמרים בתוך העמודה, בעוד שתאי מיקרוגליה עוברים דרכה.

שטפו את העמוד עם חיץ ואספו את הזרימה המכילה מיקרוגליה.

ראשית, השתמשו בסכין גילוח כדי לחתוך כל אזור במוח לחתיכות עדינות שגודלן פחות ממילימטר מעוקב אחד. בעזרת פיפטה של 1 מיליליטר כשהקצה מנותק, העבירו את חתיכות הרקמה להומוגנייזרים של Dounce מקוררים מראש. הומוגניזציה של הרקמה על ידי סיבוב איטי של הבוכנה פנימה והחוצה מההומוגנייזר של Dounce למשך 6 עד 10 משיכות מלאות עד שלא יהיו נתחים גלויים. לאחר מכן, העבירו את הרקמות המנותקות לצינורות של 50 מיליליטר דרך מסננות של 70 מיקרומטר.

שוטפים כל הומוגנייזר ובוכנה של Dounce עם סך של 6 מיליליטר מדיום קר A, ואז מעבירים את השטיפה לצינור של 15 מיליליטר לצנטריפוגה. מתלה צנטריפוגה חד תאית ב -400 פעמים גרם וב -4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עם הפסקה ב -5.

שטפו עמוד דלדול אחד גדול ושלוש עמודות בחירה גדולות במפריד מגנטי עם 3 מיליליטר MCS. כאשר הצנטריפוגה לדגימות הרקמה הושלמה, פיפטה החוצה והשליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה. השעו מחדש את התאים במאגר MCS המכיל מעכב RNase.

הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חרוזי הסרת מיאלין לכל צינור שמכיל תאים מרחפים מקליפת המוח ומהמוח הקטן, והוסיפו 50 מיקרוליטרים של חרוזים להסרת מיאלין לכל אחד מהצינורות שמכילים תאים מרחפים מההיפוקמפוס ומהסטריאטום. דגרו את הצינורות על קרח למשך 10 דקות.

לאחר מכן, הוסף MCS לצינור המכיל תאים בקליפת המוח כדי להעלות את נפחו עד 2 מיליליטר, ולצינורות הנותרים כדי להביא כל אחד מהנפחים שלהם עד 1 מיליליטר. לאחר שהעמודות ריקות ממאגר שטיפה, טען 2 מיליליטר של תאים בקליפת המוח על עמודת הדלדול הגדולה ו-1 מיליליטר של כל תרחיף תא אחר על עמודות בחירה גדולות נפרדות. לאחר מכן, שטפו את עמודת הדלדול הגדולה פעם אחת עם 1 מיליליטר של מאגר MCS, ושטפו כל עמודת בחירה גדולה פעמיים באמצעות 1 מיליליטר של מאגר MCS לכל כביסה.