טכניקה פשוטה לבידוד ותרבית אסטרוציטים מורינים

חותכים קליפת עכבר לחתיכות קטנות ומעבירים למדיום חיתוך קר המכיל תמיסת מלח חוצצת.

הוסף אנזימי עיכול כדי לנתק את המטריצה החוץ-תאית.

כדי להסיר שאריות אנזימים, יש לשטוף עם מדיום החיתוך הקר.

החלף מדיום זה במדיום העשרת אסטרוציטים.

לאחר מכן, השתמש בפיפטה כדי לנתק את חלקי הרקמה.

העבירו את התרחיף דרך מסננת כדי להסיר רקמה לא מנותקת ולקבל תאים בודדים.

העבירו את התאים לצלחת מצופה פולימר טעונה חיובית. דגירה עם טלטול.

אסטרוציטים נצמדים בחוזקה, בעוד שהנוירונים הקשורים באופן רופף, מיקרוגליה ואוליגודנדרוציטים מתנתקים.

מדיום ההעשרה ממיר אסטרוציטים בוגרים לאסטרוציטים מצולעים מתחלקים.

הסר את התאים המנותקים ושטוף אסטרוציטים עם מאגר פוספט.

הוסיפו אנזימי עיכול כדי לנתק אסטרוציטים.

הוסף סרום המכיל מדיום כדי לעצור את הפעילות האנזימטית. אוספים את האסטרוציטים בצינור ובצנטריפוגה.

השליכו את הסופרנטנט. השעיית תאים בתווך התבגרות אסטרוציטים כדי לקדם מבנה אסטרוציטים בוגר טיפוסי בצורת כוכב.

חותכים כל רקמה קליפת המוח שתשמש ליצירת אסטרוציטים לחתיכות שגודלן אינו עולה על מילימטר מעוקב אחד. לאחר איסוף כל חלקי הרקמה, המתן עד שהם יתייצבו בתחתית הצינור. לאחר מכן, שאפו כמה שיותר מדיום. לאחר מכן, הוסיפו 2 עד 3 מיליליטר של 0.05% טריפסין EDTA, ודגרו את הדגימות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

לאחר מכן, שאפו בזהירות את הטריפסין EDTA, והשאירו חתיכות רקמה בכמות מינימלית של נוזל בתחתית הצינור. לאחר מכן, הוסף 5 מיליליטר של מדיום דיסקציה מקורר מראש כדי לשטוף את שארית הטריפסין EDTA, ופיפטה לצד הצינור העליון כדי להשיג ערבוב של חלקי הרקמה. לאחר מכן שאפו את מדיום הדיסקציה והשאירו את חתיכות הרקמה בכמה שפחות נוזלים.

חזור על שלב כביסה זה עם מדיום דיסקציה מקורר מראש פעמיים. לאחר שלב הכביסה האחרון, הוסף 1 מיליליטר של DMEM PLUS בטמפרטורת החדר וטיטר את הרקמה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מבלי להכניס בועות.

אסטרוציטים רגישים למדי ל-pH, ולכן חשוב להימנע מיצירת בועות מכיוון שזה עלול לשנות את ה-pH של התמיסה.

לאחר מכן, הנח מסננת תאים של 100 מיקרון בפתח צינור של 50 מיליליטר והרטיב מראש את המסנן עם 4.5 מיליליטר של DMEM PLUS מקורר מראש. פיפטה 1 מיליליטר של תרחיף הרקמה המנותקת על מסננת התאים, והוסף עוד 4.5 מיליליטר של DMEM PLUS מקורר מראש כדי לשטוף את התאים דרכו. ביום 7 במבחנה לאחר הדיסקציה, הניחו את הכלים בגודל 10 סנטימטר עם תאים ב- DMEM PLUS על שייקר באינקובטור ונערו את הכלים ב -110 סל"ד למשך שש שעות.

20 עד 30 דקות לפני תום שש שעות הרעידות, יש לחמם מראש 1X PBS, DMEM PLUS, NB+H ו-0.25% טריפסין EDTA עד 37 מעלות באמבט המים. לאחר שש שעות של ניעור, הסר את כלי התרבות מהשייקר, והחלף מיד את המדיום ב -10 מיליליטר PBS 1X מחומם מראש למנה. לאחר מכן, הסר PBS והוסף 3 מיליליטר טריפסין EDTA מחומם מראש למנה.

לאחר מכן, דגרו את הדגימות למשך ארבע דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף 5 מיליליטר של DMEM PLUS מחומם מראש ל -3 מיליליטר טריפסין EDTA בכל מנה. שלפו את התאים מהצלחת ואספו את תרחיף התאים בצינור של 50 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את תרחיף התא ב-3,220 פעמים גרם ב-20 מעלות צלזיוס למשך ארבע דקות. לאחר מכן הסר את ה-supernatant, ואז השהה מחדש את כדור התא ב-1 מיליליטר של NB+H מחומם מראש.