פיתוח תרבות משותפת של נוירונים ומקרופאגים במבחנה

התחל עם נוירונים מבודדים של גנגליון שורש גב עכברי במדיום גידול.

זרעו אותם על צלחת מרובת בארות מצופה פולימר כדי לקדם התקשרות עצבית.

לאחר מכן, קחו עכבר שעבר המתת חסד והזריקו PBS קר כקרח לחלל הצפק שלו.

עסו בעדינות את הצפק כדי לעקור מקרופאגים מדופן הצפק.

סחטו את העכבר כדי לאסוף את נוזל הצפק ולטפל בו עם מאגר ליזה כדי ליז באופן סלקטיבי את כדוריות הדם האדומות, המופיעות כמזהמים. צנטריפוגה ולהשעות את התאים במדיום תרבית.

העבירו את המקרופאגים לתוספת נקבובית הממוקמת בתוך הבאר המכילה את הנוירונים המתורבתים.

תרבית משותפת זו מאפשרת לנוירונים ולמקרופאגים להיות בסמיכות.

טפל בתרבית המשותפת עם db-cAMP ודגירה כדי להקל על כניסתה לתאים. זה מפעיל את הנוירונים להפריש את מולקולות האיתות.

מולקולות איתות אלה, יחד עם db-cAMP, גורמות למקרופאגים לאמץ פנוטיפ פרו-רגנרטיבי ולהפריש גורמים חיוניים לצמיחה עצבית.

לפני הקמת התרבות, יש לצפות מראש צלחת בת 6 בארות עם פולי-D-ליזין ולמינין. לאחר מכן, דגרו את צלחת 6 הבארות עם 0.01 פולי-D-ליזין ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים או ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן יש לשטוף את הצלחת פעמיים במים מזוקקים.

לאחר מכן, דגרו את הצלחת בתמיסת למינין בריכוז של 3 מיקרוגרם למיליליטר למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את הצלחת פעמיים במים מזוקקים, וייבשו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות.

כעת, חתכו את העור המכסה את עמוד השדרה של עכבר שעבר המתת חסד בעזרת להב כירורגי, ונתחו את השרירים הפרה-חולייתיים באופן דו-צדדי כדי לחשוף את עצמות החוליות. הסר את עצמות החוליות בקפידה באמצעות רונדור כירורגי צר קצה עד לחשיפה מלאה של ה-DRG.

תחת מיקרוסקופ מנתח, הסר את ה-DRG באופן דו-צדדי מ-S1 עד לרמת C1 באמצעות מספריים לכריתת אירית ומלקחיים דקים. העבירו את ה-DRG לצינור אפנדורף בנפח 1.5 מיליליטר באמצעות קצה פיפטה כחול עם קצה חתוך.

לאחר מכן, הסר DMEM לאחר סיבוב מהיר למשך מספר שניות באמצעות מיני צנטריפוגה. הוסף 1 מיליליטר של DMEM המכיל 125 יחידות למיליליטר קולגנאז מסוג 11 ודגר את הצינור למשך 90 דקות בסיבוב עדין באמצעות טוויסט או שייקר ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, השליכו DMEM המכיל קולגנאז והוסיפו 1 מיליליטר של DMEM טרי. העבירו את ה-DRG לצינור חרוטי של 15 מיליליטר באמצעות קצה פיפטה כחול עם קצה חתוך. לאחר מכן, פיפטה למעלה ולמטה בעדינות, לפחות 15 פעמים כדי ליצור תרחיף תאים הומוגני.

צנטריפוגה של הצינור ב-239 גרם למשך שלוש דקות והשליכו בזהירות את הסופרנטנט עם פסולת צפה. הוסיפו 1 מיליליטר של מדיום נוירו-בזאלי בתוספת B27 והשעו מחדש את כדורית התא על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה חמש עד 10 פעמים.

לאחר מכן, העבירו את מתלה התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר המונחת על גבי צינור חרוטי של 50 מיליליטר. לאחר מכן, צלחו את כל תאי העצב של DRG שנאספו על שתי בארות של צלחת 6 הבארות.

להכנת מקרופאגים ראשוניים של הצפק מעכבר בוגר, יש לחתוך בעדינות את עור הבטן כדי לחשוף את הצפק ולהימנע מחיתוך הצפק כדי למנוע דליפה של נוזל שטיפה.

לאחר מכן, יש לנקב את הצפק באמצעות מזרק עם מחט בגודל 22 ולהזריק 10 מיליליטר PBS קר כקרח לחלל הצפק. עסו בעדינות את הצפק למשך דקה עד שתיים. לאחר מכן, משוך את המחט וסחט החוצה את ה-PBS דרך אתר ניקוב המחט, ואסוף את נוזל השטיפה בצינור חרוטי של 50 מיליליטר.

לאחר מכן, צנטריפוגה של נוזל השטיפה ב-239 גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול את הרכיבים התאיים. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה עם 3 מיליליטר של מאגר הליזיס של כדוריות הדם האדומות למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, צנטריפוגה את תרחיף התא שוב ב -239 גרם למשך 10 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. השעו מחדש את התאים הגלולים ב-1 מיליליטר של מדיום B27 נוירו-בסיסי. צלחת מחצית מכל המקרופאגים שנאספו על תוספת תרבית תאים בשטח אפקטיבי של 4.2 סנטימטרים בריבוע, המונחת על גבי באר ה-DRG המנותק.

ארבע שעות לאחר שמקרופאג הנוירון עבר תרבית משותפת, הוסף 2 מיקרוליטר של תמיסת AMP מחזורית של 100 מיקרו-מולרית למקרופאגים של תאי העצב. לאחר 24 שעות, מלאו באר ריקה במיליליטר אחד של מדיום תרבית מקרופאגים באותה צלחת בת 6 בארות.

העבר את הכנסת תרבית התאים בתרבית המשותפת של מקרופאג הנוירונים לבאר הריקה עם מדיום תרבית מקרופאגים.