שימוש בתווך מותנה מקרופאגים לקידום הרחבות נוירונים

התחל עם אדנוזין מונופוספט מחזורי, או cAMP, מולקולת איתות המווסתת תפקודים תאיים שונים. הוסף cAMP לתרבית משותפת של נוירון-מקרופאגים.

מולקולות ה-cAMP מהמדיום וגורמי הגדילה מתאי העצב מעוררים הפעלת מקרופאגים.

העבירו את התוספת עם מקרופאגים מופעלים לבאר אחרת המכילה מדיום תרבית מקרופאגים.

כאן, המקרופאגים משחררים ציטוקינים וכימוקינים לתווך, ויוצרים מדיום מותנה או CM.

צנטריפוגה את ה-CM כדי לגלול את הרכיבים התאיים.

העבירו את ה-supernatant והמסנן כדי להסיר את הפסולת התאית.

הוסף את ה-CM שנאסף לתרבית עצבית. הציטוקינים והכימוקינים ב-CM שנאסף מקדמים את הרחבות הנוירונים.

הוסף פרפורמלדהיד צונן כדי לתקן את התאים.

הוסף מאגר חוסם כדי למנוע קשירה לא ספציפית של נוגדנים. שטפו כדי להסיר את המאגר הנותר.

החל נוגדנים ראשוניים המכוונים לחלבוני השלד התא של הנוירונים. יש לשטוף כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

הוסף נוגדנים משניים מצומדים אדומים-פלואורופור הנקשרים לנוגדנים הראשוניים. יש לשטוף כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, דמיין את הנוירונים בצבע אדום עם הרחבות.

ארבע שעות לאחר תרבית משותפת של מקרופאג הנוירונים, הוסף 2 מיקרוליטר של תמיסת db-cAMP מיקרו-מולרית לתרביות המקרופאגים של הנוירונים. לאחר 24 שעות, מלאו באר ריקה במיליליטר אחד של מדיום תרבית מקרופאגים באותה צלחת בת 6 בארות.

העבר את הכנסת תרבית התאים בתרבית המשותפת של מקרופאג הנוירונים לבאר הריקה עם מדיום תרבית מקרופאגים. לאחר 72 שעות, צנטריפוגה את המדיום המותנה במקרופאגים ב-239 גרם למשך חמש דקות כדי להסיר את הרכיבים התאיים. העבירו את הסופרנטנט דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר כדי להסיר את כל הפסולת התאית שנותרה.

בהליך זה, יש לצפות מראש שקופית תאית בת 8 בארות עם פולי D-ליזין ולמינין. לאחר מכן, השג את נוירוני ה-DRG הבוגרים הקשורים בתווך נוירו-בסיסי, בתוספת B 27. צלחת 5 x 10⁴ תאים לבאר על מגלשה קאמרית מצופה מראש עם 8 בארות.

לאחר מכן, הנח את מגלשת החדר באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, ואפשר לתאים להיצמד לתחתית. לאחר מכן, החלף את מדיום התרבות במדיום מותנה מופשר שחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס. 15 שעות לאחר הציפוי הראשוני, הסר את המדיום ושטוף את התאים עם PBS פעם אחת.

לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת פרפורמלדהיד 4% קרה כקרח לבארות ודגרו את התאים עם תמיסת הפרפורמלדהיד למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, דגרו את התאים הקבועים בתמיסת נוגדנים ראשונית, מדוללת בסרום עיזים רגיל של 10% למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, צלמו תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לדמיין את צמיחת הנויריטים.