מעקב אחר הובלה אקסונלית של אברונים בנוירונים מוטוריים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי

התחל עם תא מיקרופלואידית מצופה פולימר עם בארות פרוקסימליות ודיסטליות המחוברות באמצעות מיקרו-חריצים מרובים.

בבאר הפרוקסימלית, הניחו רקמות חוט שדרה עובריות של עכברים עשירות בנוירונים מוטוריים מתפתחים.

השלם זאת היטב עם מדיום תזונתי. דגירה כדי לאפשר צמיחת נוירונים והיצמדות למשטח המצופה פולימר.

מאוחר יותר, הוסף מדיום תזונתי נטול גורם גדילה לבאר הפרוקסימלית.

בבארות דיסטליות, הוסף נפח גבוה יותר של מדיום תזונתי המכיל גורמי גדילה כדי ליצור הבדלי ריכוז ונפח.

הבדלים אלה גורמים לאקסונים, ההקרנות העצביות הארוכות יותר, לצמוח לכיוון הבארות הדיסטליות דרך המיקרו-חריצים.

הוסף תמיסת צבע פלואורסצנטי לשתי הבארות.

מולקולות הצבע נכנסות לתאי העצב ומכתימות את המיטוכונדריה והאברונים החומציים בשני הקצוות.

בהדמיה קונפוקלית חיה, אברונים מוכתמים פלואורסצנטיים נעים בשני הכיוונים בין גופי התאים העצביים לאקסונים, ומאשרים הובלה אקסונלית בנוירונים מוטוריים.

השלך את כל המדיום מהתא הפרוקסימלי של ה-MFC. הרם חוט שדרה בודד עם פיפטה בנפח כולל של ארבעה מיקרוליטר והזריק אותו קרוב ככל האפשר למערה. משוך את כל עודפי הנוזלים מהבאר הפרוקסימלית דרך השקעים הרוחביים. חזור על השלב הקודם פעמיים נוספות, וודא שהאקספלנטים מוטמעים בערוץ הפרוקסימלי. לאט לאט, הוסף 150 מיקרוליטר של מדיום SCEX לבאר הפרוקסימלית.

יום לאחר הציפוי, החלף את מדיום ה-SCEX בתא הפרוקסימלי, והוסף מדיום SCEX עשיר לתא הדיסטלי, תוך שמירה על שיפוע נפח של לפחות 15 מיקרוליטר לבאר בין הבארות הדיסטליות והפרוקסימליות. לאחר ארבעה עד שישה ימים, האקסונים צריכים לעבור לתא הדיסטלי ולהיות מוכנים להדמיית הובלה אקסונלית.

כדי לתייג את התאים המיטוכונדריים והחומציים, הכינו מדיום SCEX טרי עם 100 ננו-מולרית Mitotracker FM אדום עמוק ו-100 ננו-מולרי LysoTracker אדום, והוסיפו אותו לתאים המיקרופלואידיים. דגרו אותם במשך 30 עד 60 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שטפו שלוש פעמים עם מדיום SCEX חם. המשך בהדמיה חיה של הובלה אקסונלית, ורכוש סדרת תמונות של 100 פעמים במרווחים של 3 שניות עם סך של 5 דקות לסרט.