בידוד ותרבית של נוירונים ראשוניים וגליה משלפוחית השתן של חולדה

קחו חולדה שהורדמה.

פתחו את הבטן, כרתו את שלפוחית השתן וטבלו אותה במאגר.

חותכים את שלפוחית השתן ומסירים שומן דבק ופסולת רקמות.

העבירו את שלפוחית השתן לצינור המכיל חיץ, צנטריפוגה והוציאו את הפסולת.

מניחים את הרקמה בתמיסה המכילה קולגנאז וטוחנים אותה. הוסף עוד קולגנאז כדי לפרק את המטריצה החוץ-תאית, ולשחרר את התאים.

צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט. הוסף טריפסין כדי לשבש את הצמתים בין תא לתא, ולשחרר את התאים.

הוסיפו חומר שטיפה המכיל חלבונים כדי לנטרל את הטריפסין, ולאחר מכן את הצנטריפוגה, והסירו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את התאים במדיה; סננו אותם כדי להסיר אגרגטים וקבלו תרחיף של תא בודד.

צנטריפוגה והסר את הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים במדיה.

צלח את התאים על כיסויים מצופים כדי להקל על חיבור תאי עצב וגליה. הסר את התאים שאינם מחוברים.

הוסף מדיה נוירונית המכילה גורמי גדילה כדי לקדם התבגרות תאית, תוך יצירת תרבית עצבית וגליה ראשונית.

התחל בהנחת חולדות על מגבת כירורגית מעוקרת וחשיפת הבטן. השתמש במספריים ובמלקחיים כדי לפתוח את חלל הבטן ולחשוף את שלפוחית השתן. השתמש בסט נוסף של מספריים ומלקחיים כדי להרים בעדינות את שלפוחית השתן ולחתוך אותה מצוואר שלפוחית השתן.

לאחר מכן, הנח במהירות את שלפוחית השתן בתמיסת קרבס קרה ויציבה בחמצן כדי לשפר את הישרדות התאים. הוסיפו את תמיסת קרבס לשלוש צלחות זכוכית ושלוש כוסות זכוכית והניחו אותן באמבט קרח לקירור מראש. מספר את הכלים והכוסות 1, 2 ו -3 כדי למנוע בלבול.

בצלחת זכוכית 1, פתחו את שלפוחית השתן בעזרת מספריים עיניים ופרשו אותה בעזרת מלקחיים ומחלק גרעין כפות. שוטפים את שלפוחית השתן בכוס זכוכית 1 ומניחים אותה בכלי זכוכית 2. הסר שומן דבק על פני הרקמה באמצעות המלקחיים ומספרי העיניים. לאחר מכן, שטפו את שלפוחית השתן בכוס 2 והניחו אותה בכלי 3.

מגרדים בעדינות את שלפוחית השתן באמצעות המלקחיים ומפריד הגרעין של הכפות כדי להסיר חיבורים אקסוגניים. שוטפים את שלפוחית השתן בכוס זכוכית 3 ומעבירים אותה לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר עם 14 מיליליטר תמיסת קרבס קרה. צנטריפוגה את הדגימה למשך דקה אחת ב -360 פעמים גרם ו -4 מעלות צלזיוס.

העבירו את שלפוחית השתן מצינור הצנטריפוגה לבקבוקון של 2 מיליליטר המכיל 1 מיליליטר תמיסת עיכול. השתמש במספריים עיניים כדי לחתוך את שלפוחית השתן לחתיכות קטנות. מערבבים את תמיסת שלפוחית השתן עם 9 מיליליטר תמיסת עיכול 1 בכלי תרבית תאים סטרילי. בצע את העיכול הראשון בחממה רועדת למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני ב-200 סל"ד. לאחר העיכול הראשון, יש לצנטריפוגה את התמיסה ב -300 פעמים גרם ו -4 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות.

בינתיים, הניחו את תמיסת העיכול 2 באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס לחימום מראש. לאחר צנטריפוגה, הסירו את רוב הסופרנטנט שמכיל תמיסת עיכול 1, והשאירו חלק מהסופרנטנט כדי למנוע אובדן תאים.

השעו מחדש את התאים בתמיסת עיכול חמה 2 ונערו את התערובת תוך כדי עיכול באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר השלמת העיכול, השבת מיד את הטריפסין על ידי הוספת 10 מיליליטר של חומר שטיפה קרה. צנטריפוגה את התאים ב -360 פעמים גרם ו -4 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות. לאחר מכן, הסר כמה שיותר סופרנטנט כדי לחסל את כל הטריפסין.

השעו בעדינות משקעים עם 3 מיליליטר של מדיה נוירונית, והקפידו לא ליצור בועות אוויר בתמיסה. סנן את המתלה דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. אסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב -360 פעמים גרם ב -4 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות. לאחר מכן, השעו בעדינות את כדורי התא ב-1 מיליליטר של מדיה נוירונית A והוסיפו 500 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל באר של צלחת של 48 בארות. תאי תרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.