יצירת תרביות תאי גנגליון רשתית ראשוניים מעוברי דגי זברה

התחל עם עוברי דג זברה בשלב התפתחותי מוקדם במדיה עוברית.

הסר את הכוריון, קרום המגן המקיף את העוברים, והעביר את העוברים לצלחת תרבית טרייה המכילה מדיה.

הסר את חלק הזנב של העובר, ואז הפרד את הראש ונתק בעדינות את העיניים מהראש.

העיניים מכילות את הרשתית, שכבה דקה של רקמה המאכלסת את תאי הגנגליון ברשתית.

העבירו את העיניים לצינור המכיל מדיה לתרבית תאי דג הזברה.

ניתוק מכני של העיניים כדי לשחרר את תאי הגנגליון ברשתית וליצור תרחיף חד-תאי.

קח כיסויים המונחים בצלחת תרבית המכילה מצע גידול דג זברה.

הכיסויים מצופים בפולימר סינטטי וחלבון הידבקות.

העבירו את התאים למרכז הכיסוי ודגרו.

תאי גנגליון ברשתית נצמדים למשטחים המצופים, ויתרה מכך, תאים אלה מפתחים הקרנות ארוכות הנקראות אקסונים.

הוציאו עוברי דג זברה מהחממה, וטבלו עוברים בצלחת תרבית רקמה בגודל 35 מילימטר המכילה 70% אתנול, למשך 5 עד 10 שניות כדי לעקר אותה. באמצעות פיפטת העברה, העבירו עוברים לצלחת E2 Media #1 המכילה מדיה E2 סטרילית כדי לשטוף עודפי אתנול. לאחר מכן, העבירו את העוברים לצלחת E2 Media #2, והסירו את הכוריונים שלהם בעזרת מלקחיים חדים. לבסוף, העבירו עוברים לצלחת E2 Media #3 כדי לבצע דיסקציות.

בעזרת זוג מלקחיים עדינים, מקם והחזק את העוברים קדמיים לחלמון עם אחד המלקחיים, והסר את הזנב האחורי לשק החלמון עם המלקחיים האחרים. תפסו את הצוואר בעזרת מלקחיים והסירו את הראש כדי לחשוף את המוח והעיניים למדיה E2. בעזרת קצה המלקחיים העדינים, גלגלו בעדינות את העיניים מהראש תוך החזקת רקמת הגולגולת כלפי מטה בעזרת המלקחיים השניים. העבירו ארבע עיניים לאחד הצינורות שהוכנו בעבר המכילים ZFCM+.

יש למשוך בעדינות למעלה ולמטה עם פיפטת P20 כ-45 פעמים כדי לנתק תאים. העבר את ה-ZFCM+ עם התאים המנותקים למרכז החלקות הכיסוי. שמרו על תרביות על הספסל בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס, על מתלה קצף פוליסטירן לספיגת רעידות. ביום ההדמיה, בדוק תאים תחת המיקרוסקופ כדי לאמת את הצמיחה של אקסוני RGC.