הכנת תרביות פרוסות צפות ממוח אנושי בוגר

קחו רקמת מוח אנושית שקועה בתמיסת חיתוך. ה-pH הביולוגי והחומרים המזינים של התמיסה מסייעים בשמירה על תפקוד הרקמות.

הסר את שכבת קרומי המוח החיצונית ביותר, וחתוך את הרקמה ליצירת משטח ישר.

כתם תמיסה עודפת מהרקמה. חבר את הרקמה הגזומה לדיסק דגימה עם בלוק אגרוז, תוך שמירה על הרקמה במגע עם הבלוק כדי להקל על החיתוך.

הנח את הדיסק במגש חיץ ויברטום וכסה את הטישו בתמיסת חיתוך קרה כקרח.

בעזרת הוויברטום, צור פרוסות אחידות המשמרות את ארכיטקטורת הרקמה.

חתוך רקמות עודפות, והבטיח שיעור עקבי של חומר אפור ולבן.

מניחים את הפרוסות בצלחת מרובת בארות המכילה מדיום תרבות ודוגרים.

הפרוסות נשארות תלויות בתווך כדי להבטיח גישה אחידה לחומרים מזינים, טכניקה המכונה תרבית פרוסות צפה חופשית.

יש לחדש את התרבית באופן קבוע במדיום המכיל גורם גדילה עצבי כדי לשמור על חיוניות הרקמות.

העבירו את הדגימה לצלחת פטרי המכילה תמיסת חיתוך. בעזרת כלים כירורגיים עדינים, הסר בזהירות כמה שיותר מקרומי המוח שנותרו. בחר את כיוון הדגימה הטוב ביותר לייצור פרוסות עם המאפיינים המיוחדים של העיצוב הניסיוני, והשתמש בלהב אזמל מספר 24 כדי לקצץ משטח שטוח שיהיה הבסיס שיודבק לדיסק הדגימה.

בעזרת כף פלסטיק חד פעמית ומברשות צבע עדינות, אוספים את השבר מצלחת הפטרי, ומייבשים עודפי תמיסה בעזרת נייר פילטר. לאחר מכן, השתמש בדבק סופר כדי לחבר את הרקמה לצלחת דגימת הוויברטום עד שהיא נדבקת היטב לכלי ובמגע עם גוש האגרוז.

הנח את דיסק דגימת הוויברטום לתוך מגש המאגר של הוויברטום. נעל את מחזיק הסכין במקומו כשסכין הגילוח מקובע היטב. הוסף תמיסת חיתוך וודא שהוא מכסה גם את הדגימה וגם את הלהב. לאחר מכן, התחל לפרוס את הדגימה לפרוסות של 200 מיקרומטר.

מעבירים את הפרוסות ממגש החיץ לצלחת פטרי המכילה תמיסת חיתוך וחותכים את כל הקצוות הרופפים ועודפי החומר הלבן לפרופורציה של כ -70% קליפת המוח ו -30% חומר לבן. בארון זרימה למינרית, הוסיפו 600 מיקרוליטר של מדיום תרבית לכל באר של צלחת של 24 בארות ודגרו בחום של 36 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 20 דקות לפחות לפני ציפוי הפרוסות. לאחר מכן, השתמש במכחול כדי לצלחת פרוסה אחת בכל באר.

אם יש בארות שאינן בשימוש בצלחת, מלאו אותן ב -400 מיקרוליטר מים סטריליים. דגירה בטמפרטורה של 36 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. השלם 10 מיליליטר ממדיום התרבות שהוכן בעבר עם גורם נוירוטרופי שמקורו במוח בריכוז של 50 ננוגרם למיליליטר.

לאחר 8 עד 16 שעות, הסר 333 מיקרוליטר מהמדיום הממוזג מכל באר והוסף 133 מיקרוליטר של מדיום טרי בתוספת BDNF. החלף שליש מהמדיום המותנה במדיום טרי בתוספת BDNF כל 24 שעות.