בידוד ותרבית של תאי מיקרוגליה ממוחות של חולדות באמצעות מדיה נטולת סרום

קחו למשל מוח של עכברוש מפוצץ. טוחנים אותו לשברים קטנים.

הומוגניזציה של הרקמה במאגר כדי לשחרר תאים, כולל מיקרוגליה.

לאחר שהרקמה הלא מעוכלת מתייצבת, אספו את התאים המכילים סופרנטנט והוסיפו חוצץ הפרדת מיאלין.

מערבבים את התכולה והצנטריפוגה כדי להפריד תאים מהמיאלין והפסולת. יש להסיר את שכבת פסולת המיאלין ואת העל-נטנט.

השעו מחדש תאים במאגר ופיפטה כדי להפריד גושים.

העבירו את המתלה דרך מסננת כדי להסיר את אגרגט התאים הנותרים.

העבירו את התאים המסוננים לצלחת תרבית המצופה בנוגדנים חד-שבטיים ספציפיים למיקרוגליה. דגירה כדי להקל על הידבקות מיקרוגליה.

יש לשטוף עם חוצץ כדי להסיר תאים שאינם נדבקים. מוסיפים טריפסין ודוגרים כדי לשחרר מיקרוגליה.

הסר טריפסין.

הוסיפו מדיה ללא סרום. דגירה על קרח כדי להחליש אינטראקציות בין תא למצע.

פיפטה ואוספים את המתלה בצינור. צנטריפוגה והסר את הסופרנטנט.

השהה מחדש את המיקרוגליה במדיה נטולת סרום והעביר לצלחת מרובת בארות מצופה קולגן. דגירה כדי להקל על הידבקות מיקרוגליה.

הוסף מדיה עם גורמי גדילה ושומנים. דגירה להבשלת מיקרוגליה.

לאחר שהמוחות נאספו ב-DPBS קרים, קוצצים כל מוח לקוביות של מילימטר אחד בצלחת פטרי על קרח עם להב אזמל קר, ומעבירים להומוגניזטור Dounce קר כקרח עם 5 עד 7 מיליליטר של חוצץ קר כקרח. לאחר מכן, השתמש בהומוגנייזר Dounce רופף כדי לנתק את הרקמה עם 10 עד 20 משיכות עדינות ולא שלמות. הקפד לא לרסק ישירות את הרקמה בתחתית ההומוגנייזר. במקום זאת, דחף את הרקמה דרך הרווח שבין דפנות הבוכנה להומוגניזטור.

חשוב להומוגניזציה איטית של הרקמה עם סבבים מרובים של סינון כדי לשמר את כדאיות המיקרוגליה.

לאחר מכן, הסר בזהירות את הבוכנה כדי למנוע הכנסת בועות אוויר. אפשר לגושי רקמה מנותקים בצורה גרועה להתיישב בתחתית ההומוגנייזר, ולהעביר את הסופרנטנט לצינור חרוטי חדש ומקורר של 50 מיליליטר. לאחר מכן, החלף את הנפח שהוסר במאגר נימוס טרי, וחזור על הליך הדיסוציאציה בסך הכל שלושה עד ארבעה סבבים, או עד שכל הרקמות התנתקו.

בהליך זה, הוסף מאגר ניפוח קר כקרח לצינור החרוטי של 50 מיליליטר המכיל את מתלה התא, והתאם את הנפח הכולל ל-33.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר MSB לתרחיף התא, וערבב היטב על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. זה יביא לריכוז סופי של 23% של MSB בנפח של 43.5 מיליליטר.

לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים למשך 15 דקות בטמפרטורה של 500 גרם ב-4 מעלות צלזיוס עם בלימה איטית. לאחר מכן, הסירו את השכבה העליונה של המיאלין, והפסולת, ואת הסופרנטנט בעזרת פיפטה. היזהר בעת הסרת השכבה העליונה כדי להבטיח שכמה שיותר ממנה יוסרו.

לאחר מכן, השעו מחדש את כדור התא ב-12 מיליליטר של מאגר פאנינג. יש לשלש בעדינות את תרחיף התאים, כדי לפרק את כל גושי התאים שנותרו. בשלב זה, העבירו את מתלה התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי להסיר פסולת גדולה או גושי תאים. שטפו את צלחת הפאנינג המצופה OX42 שלוש פעמים עם DPBS. אל תאפשר לצלחת להתייבש לחלוטין בין כביסות.

יוצקים את שטיפת ה-DPBS האחרונה ומורחים את מתלה התאים המסוננים על צלחת הפאנינג. סובב בעדינות את הצלחת כדי להפיץ את התאים. לאחר מכן, דגרו את הצלחת על משטח ישר בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כדי לאפשר לתאים להידבק. אין לדגור יותר מ -20 דקות, אחרת התאים יתקשו מאוד להתאושש מהמנה. לאחר מכן, שטפו את צלחת הפאנינג עם DPBS 10 פעמים כדי להסיר תאים שאינם נדבקים.

מיקרוגליה תהיה מחוברת היטב לצלחת, לכן סובבו את הצלחת בכל שטיפה כדי להבטיח הסרה של תאים אחרים שאינם נדבקים. יוצקים את שטיפת ה- DPBS האחרונה, ומחליפים ב -15 מיליליטר DPBS ו -200 מיקרוליטר טריפסין.

כדי לנסות את התאים, דגרו את המנה למשך פחות או שווה ל-10 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות של טריפסיניזציה, מיקרוגליה עדיין תהיה דבוקה לצלחת. יוצקים את התערובת ושוטפים בעדינות את הצלחת פעמיים עם DPBS כדי להסיר את הטריפסין. לאחר מכן, החלף ב -12 מיליליטר MGM קר כקרח.

לאחר מכן, הניחו את צלחת הפאנינג על קרח למשך שתי דקות כדי לעזור להחליש את האינטראקציה בין התאים והמצע, וודאו שהצלחת שטוחה כדי למנוע התייבשות של אזורים בכלי הפאנינג. לאחר מכן, פיפטה במרץ עם פיפטה של 10 מיליליטר ובקר פיפטה במהירות גבוהה כדי לשחזר תאים מצלחת הפאנינג. ציירו רשת בגודל 16 על 16 עם זרם הנוזל מהפיפטה כדי לנסות להסיר את כל התאים.

חשוב למצוא איזון בין התאוששות התאים הכוללת לבין בריאות התרבית שלך. פיפטינג חוזר ונשנה של סופרנטנט תאים כנגד צלחת הפאנינג יביא להפחתת הכדאיות של התרבית שלך.

בדוק את התאים במיקרוסקופ בהגדלה של פי 20 כדי לוודא שהם התנתקו מהצלחת. סמן את הכתמים על גבי הכלי שבהם תקועים תאים וחזור על פיפטינג באזורים אלה. אסוף את תרחיף התאים והוציא 3 עד 4 מיליליטר של סופרנטנט בכל צינור חרוטי של 15 מיליליטר. סובב אותו במשך 15 דקות בחום של 500 גרם ב -4 מעלות צלזיוס עם בלימה איטית.

לאחר 15 דקות, שאפו את הסופרנטנט והשאירו 0.5 מיליליטר MGM עם כדור התא. לאחר מכן, השעו מחדש כל כדור ב-MGM הנותר ואגד את התאים מכל הצינורות. לאחר מכן, ספרו את התאים בעזרת ההמוציטומטר.

כעת, צלחו 15 מיקרוליטר של ציפוי קולגן IV ישירות במרכז צלחת תרבית רקמה אניונית מצופה קטיוני עם 24 בארות, ודגרו למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר ספירת התאים עם המוציטומטר, יש לדלל אותם ל -2.3 x ^10-5 למיליליטר ב- MGM. שאפו את נקודת הקולגן IV, וצלחו מיד 15 מיקרוליטר של תרחיף תאים לנקודה זו כדי להניב 3.5 x 10³ תאים לכל נקודה.

לאחר מכן, דגרו במשך חמש עד עשר דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לתאים להידבק. לאחר מכן, הוסף בעדינות 500 מיקרוליטר של TIC מאוזן CO₂ לבאר.