בידוד וטיפוח של תאי גזע עצביים בוגרים מהאזור התת-קלוסלי של העכבר

נתחיל עם מוח של עכבר על מטריצת מוח צוננת.

השג קטעים המכילים את האזור התת-קלוסלי או SCZ. העבירו את החלק למאגר פוספט קר.

תחת מיקרוסקופ מנתח, גזרו את חלק ה- SCZ.

קוצצים את ה- SCZ המנותח לחתיכות קטנות יותר.

העבירו את החלקים הללו למאגר עיכול. דגירה כדי לנתק את התאים מהרקמה.

צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים במדיום מתאים.

העבירו את התאים לצלחת תרבית והוסיפו גורמי גדילה ספציפיים.

תאי הגזע העצביים הבוגרים מתחלקים ויוצרים אשכולות הנקראים נוירוספרות.

חלוקה לא נכונה של חומרים מזינים באשכולות תאים מגבילה את צמיחת התאים.

כדי לפזר את האשכולות, צנטריפוגות והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את האשכולות במאגר דיסוציאציה ודגרו.

פיפטה את התמיסה למעלה ולמטה כדי ליצור תאים בודדים.

צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את התאים והעבירו אותם למדיום מתאים לקבלת חד-שכבה.

לאחר הניתוח, העבירו את מוח העכבר למאגר PBS קר, ושטפו אותו פעמיים כדי להסיר עודפי דם. לאחר מכן, הניחו את המוח במטריצת המוח על קרח, ובצעו חתכים עטרתיים כדי לקבל פרוסות בעובי של מילימטר אחד. לאחר מכן, העבירו את פרוסות המוח האחוריות המכילות אזורי SCZ ל-PBS קר.

תחת מיקרוסקופ מנתח עם הגדלה נמוכה, ניתחו את ה-SCZ מאזור החומר הלבן של קליפת המוח וההיפוקמפוס בעזרת מחט כפופה בקוטר 30. לאחר מכן, הסירו את אזורי קליפת המוח מעל ה-SCZ, והניחו את ה-SCZ המנותח לתוך PBS קר בצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר על קרח.

ניתן לנתח את אזור האזור התת-קלוסלי במדויק מכל הרקמה באמצעות מטריצת מוח ומחט כפופה בגודל 30.

לאחר מכן, הסר את ה- PBS ולאחר מכן, קוצץ מיד את הרקמות המנותחות לחתיכות קטנות. השעו אותם מחדש עם מיליליטר אחד של מאגר עיכול. לאחר מכן, העבירו את הדגימה לצינור של 15 מיליליטר המכיל שני מיליליטר של מאגר עיכול. לאחר מכן, דגרו אותו למשך 30 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.

בשלב זה, הקש על הצינור בעדינות כדי לנתק את הרקמה המעוכלת, ולאחר מכן צנטריפוגה את הצינור ב -145 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את הרקמה המעוכלת עם מיליליטר אחד של מחמם מראש ושניים בינוניים כדי לשטוף את מאגר העיכול, ופיפטו בעדינות את תמיסת הדגימה מקסימום חמש פעמים.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה שוב ב -145 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את כדור התא במיליליטר אחד של מדיום N2. מניחים מיליליטר אחד של מדיום N2 בצלחת שש בארות לא מצופה, ומוסיפים מיליליטר אחד מהתאים התלויים כדי ליצור נפח סופי של שני מיליליטר.

לאחר מכן, הוסף 20 ננוגרם למיליליטר EGF ו-20 ננוגרם למיליליטר bFGF לכל באר. נער בעדינות את צלחת התרבית בת שש הבארות ביד כדי לערבב את גורמי הגדילה הנוספים עם התאים המצופים. לאחר מכן, שמור את צלחת שש הבארות בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

הוסף 20 ננוגרם למיליליטר EGF ו-20 ננוגרם למיליליטר bFGF לכל באר כל יום למשך שמונה ימים. כל שלושה ימים, הוסף 200 מיקרוליטר של מדיה N2 כדי לשמור על כשני מיליליטר מהמדיום. הנה תמונה של הנוירוספרות לאחר שמונה ימים.

בהליך זה, אספו את הנוירוספרות והעבירו אותן לצינור חרוטי חדש בגודל 15 מילימטר. צנטריפוגה את הצינור ב -145 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את הנוירוספרות עם 0.5 מיליליטר של מאגר דיסוציאציה. דגרו אותם עם 0.5 מיליליטר של מאגר דיסוציאציה למשך חמש דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס כדי לפרק את הנוירוספרות לתאים בודדים.

פיפטה בעדינות את תמיסת הדגימה למעלה ולמטה פחות מחמש פעמים, וצנטריפוגה של הצינור ב-145 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את הנוירוספרות עם מיליליטר אחד של מדיום N2. לאחר ציפוי צלחת בת שש בארות בלמינין PLL, צלחו את התאים בגודל 2.5 x 10⁵ תאים למיליליטר עם שני מיליליטר של מדיום N2 לבאר. שמור על תאי גזע עצביים בוגרים SCZ עם טיפול יומיומי בגורמי גדילה במשך חמישה ימים לפני העברתם.