בידוד תאי חיסון חודרי גידול ממוח מוריני

קחו למשל מוח עכבר מפוצץ המכיל גידול.

שלב הזלוף מסיר תאי חיסון במחזור הדם אך שומר על התאים שחדרו לגידול.

בודד את הרקמה המכילה את הגידול.

כעת, נתק את הרקמה באופן מכני.

הכוח המכני משחרר את הרקמה ומשחרר את התאים.

העבירו את הרקמה המנותקת לצינור.

צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט המכיל פסולת.

השעו מחדש את הרקמה בתמיסת עיכול המכילה קולגנאז ו- DNase.

קולגנאז מפרק את המטריצה החוץ-תאית, ומשחרר את התאים. DNase מפרק DNA מזהם.

הוסף מאגר כדי לעצור את הפעילות האנזימטית.

סנן את המתלה כדי להסיר אגרגטים של תאים ולקבל מתלה חד-תא

.

צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט.

השעיה מחדש של תאים במדיום שיפוע בצפיפות גבוהה. כעת, שכבת-על עם מדיום שיפוע בצפיפות נמוכה יותר, היוצר שיפוע הפרדה עם ממשק ברור.

צנטריפוגה להפרדת שכבות. תאי חיסון מתאספים בממשק בין מדיומים שיפועיים בזמן שפסולת תאים צפה מעל.

אסוף את תאי החיסון להמשך ניתוח.

בהליך זה, באמצעות סכין גילוח נקי בעל פיפיות, בודדו את אזור המוח, המכיל את הגידול על ידי ביצוע חתך סגיטלי במרכז המוח כדי לחצות את שתי ההמיספרות. סובב את הצד המדיאלי של חצי הכדור המקביל כלפי מטה, ובצע חתך עטרה אחד במוח הקטן, וחתך נוסף בפקעת הריח כדי לבודד את רקמת המטרה המכילה את שתל הגידול.

לאחר מכן, הנח את רקמת המטרה במטחנת הרקמות הזכוכית המסומנת, המכילה 1 מיליליטר DPBS. דחוף את הבוכנה עד הסוף, וסובב שבע פעמים כדי לשבש את הרקמה. לאחר מכן, הרם את הבוכנה כדי לאפשר לנוזל להתיישב בחזרה לתחתית מטחנת הרקמות. חזור על שלב זה שלוש פעמים. עם זאת, סובב את הבוכנה רק ארבע פעמים במהלך שתי החזרות הבאות ושלוש פעמים במהלך החזרה האחרונה כדי למנוע טריטורציה יתר של רקמת המוח.

לאחר מכן, מרחו שלושה נפחים של 1 מיליליטר של DPBS קר כקרח על דפנות הבוכנה כדי לשטוף את שאריות חומר המוח לתוך מטחנת הרקמות. לאחר מכן, השעו מחדש את חומר המוח המשולש על ידי פיפטינג למעלה ולמטה והניחו לתוך צינור צנטריפוגה מסומן של 15 מיליליטר על קרח. שטפו את דפנות מטחנת הרקמות DAPS עם 1 מיליליטר נוסף של DPBS קר כקרח והוסיפו לאותו צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר.

שמור את כל הצינורות המכילים חומר מוחי משולש על קרח, עד שכל הדגימות מעובדות. לאחר מכן, סובבו את החומר המוחי המשולש בצינורות הצנטריפוגות של 15 מיליליטר ב-740 פעמים גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את חומר המוח הגלולי במיליליטר אחד של תערובת שהוכנה קודם לכן של אנזימי עיכול קולגנאז ו-DNase I.

הנח את צינורות הצנטריפוגה בנפח 15 מיליליטר לתוך מתלה מבחנה, והנח את המתלה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן, ערבב בעדינות את הדגימות פעמיים לאורך תקופת הדגירה על ידי החלקת הצינורות כדי להקל על פירוק הרקמות.

לאחר מכן, הוסף 6 מיליליטר DPBS קר כקרח לכל צינור כדי לדלל את אנזימי העיכול. פיפטה למעלה ולמטה כדי להשהות, ולסנן את הנפח הכולל דרך מסנני רשת ניילון סטריליים של 70 מיקרון לצינורות צנטריפוגה חדשים של 15 מיליליטר על קרח.

לאחר מכן, סובב את תרחיף תאי המוח כלפי מטה ב-740 פעמים גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להשיג כדור חד-תאי. הסר את הצינורות של 15 מיליליטר מהצנטריפוגה והניח אותם על קרח. לאחר מכן, הגדל את הגדרת הטמפרטורה בצנטריפוגה לכ-21 מעלות צלזיוס כהכנה לשלב הבא.

לאחר מכן, הסר לחלוטין את הסופרנטנט של התא ותחילה השהה מחדש את כדורי התא ב-1 מיליליטר של מדיית צנטריפוגה בצפיפות של 70%, באמצעות מיקרו-פיפטה P1000. לאחר מכן, הוסף ארבעה מיליליטר נוספים של מדיית צנטריפוגה בצפיפות של 70% לכל צינור. שים את הכובעים בצורה מאובטחת והומוגניזציה של מתלה התאים על ידי היפוך עדין של הצינור מספר פעמים.

לאחר מכן, העבירו את צינורות הצנטריפוגה של 15 מיליליטר, המכילים תאי מוח תלויים באמצעי צנטריפוגה בצפיפות של 70% מקרח למבחנה בחזרה בטמפרטורת החדר. בזה אחר זה, שכב בזהירות 2 מיליליטר של תמיסת מדיית צנטריפוגה בצפיפות של 37% על 5 מיליליטר של מדיית צנטריפוגה בצפיפות של 70% כדי ליצור ממשק נקי בין שתי שכבות מדיית הצנטריפוגה בצפיפות.

לאחר מכן, סמן את מיקום הממשק בין שתי השכבות עם טוש בעל קצה עדין כך שניתן יהיה לזהות אותו בקלות לאחר צנטריפוגה כאשר ההבחנה הופכת פחות ברורה. סובב את צינורות הצנטריפוגה של 15 מיליליטר ב-740 פעמים גרם למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ללא הפסקה כדי למנוע שיבוש הממשק בין שכבות המדיה של צנטריפוגת הצפיפות.

לאחר מכן, אסוף את ה-PBMCs שהצטברו בממשק בין שתי שכבות אמצעי הצנטריפוגה בצפיפות על ידי החדרת מיקרופיפטה P200 לתוך הצינור, תוך עקיפת שכבת השומנים בזהירות. ברגע שהגעתם לרמת רצועת ה-PBMC, חלצו לאט לאט 200 מיקרוליטר מפני השטח של שכבת המדיה של צנטריפוגה בצפיפות של 70% והעבירו לצינור פוליפרופילן FACS המסומן בהתאמה על קרח. חזור על שלב זה פעם אחת כדי להשיג נפח כולל של 400 מיקרוליטר לדגימה.