הסרה סלקטיבית של תאי מיקרוגליה מתרבית נוירונים של גרגיר המוח הקטן של חולדה

קח מוח מוח חולדה שנקטף וקוצץ אותו לשברים.

מעבירים את השברים לצינור המכיל טריפסין ודוגרים.

טריפסין מעכל את המטריצה החוץ-תאית של הרקמה, ומשחרר את תאי העצב של גרגירי המוח הקטן, כמו גם תאים שאינם עצביים כגון מיקרוגליה ואסטרוציטים.

הוסף מאגר המכיל מעכב טריפסין ו-DNase. המעכב מנטרל את הטריפסין ואילו ה-DNase מפרק את ה-DNA המזהם.

צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את הרקמה במאגר המכיל את המעכב וה-DNase, ונתקו אותה מכנית ליצירת תרחיף חד-תאי.

שכב את התרחיף על תמיסת חיץ המכילה חלבון.

צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט המכיל פסולת תאית.

השעו מחדש את התאים במדיה וזרעו אותם על כיסויים מצופים פולי-ליזין כדי להקל על החיבור התאי.

הסר את המדיה. שטפו את התאים במדיה טרייה, ולאחר מכן הוסיפו מדיה המכילה מעכב מחזור תא כדי למנוע התפשטות תאי גליה.

החלף מחצית מהמדיה במדיה טרייה המכילה מעכב ליזוזום.

המעכב מכוון באופן סלקטיבי למיקרוגליה ומשבש את הממברנות הליזוזומליות, וגורם למוות של מיקרוגליה ולהסרה מהתרבית.

התחל הליך זה על ידי איסוף המוח הקטן מגורי חולדות בני ארבעה עד שבעה ימים. מניחים אותם מיד בצלחת פטרי המכילה חמישה מיליליטר תמיסה A על קרח. לאחר מכן, הסר עודפי תמיסה מהמוח הקטן והנח את הרקמה במכסה צלחת הפטרי. לאחר מכן, קוצצים את הרקמה דק בעזרת סכין גילוח להבה היטב לשלושה כיוונים שונים לפחות.

לאחר מכן, הוסיפו את הרקמה הקצוצה לתמיסה B. הניחו אותה באמבט מים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ונערו אותה בעדינות כל כמה דקות. לאחר מכן, הוסף 20 מיליליטר של תמיסה D לצינור כדי לנטרל את הטריפסין. מנערים וצנטריפוגה בחום של 65 גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן, שפכו את הסופרנטנט. השעו אותו בארבעה מיליליטר של תמיסה C.

שלש את הדגימה 10 פעמים עם כל אחת משלוש פיפטות הזכוכית המולהבות בקוטר הולך ופוחת עד שהמתלה הומוגני ככל האפשר. לאחר מכן, הוסיפו לאט ובעדינות כמה טיפות של ההומוגנט הזה על גבי ה-BSA-EBSS. אם הוא מתחיל לשקוע דרך ה-BSA-EBSS, יש לשלש עוד ולהוסיף עוד קצת תמיסה C. ההומוגנאט צריך לשבת בשכבה על גבי ה-BSA-EBSS.

סובב אותו בחום של 100 גרם למשך חמש דקות, ואל תנער אותו. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום MEM. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר, וצלחו אותם ב-800,000 תאים לכל כיסוי ב-500 מיקרוליטר של מדיום MEM. לאחר מכן, הניחו אותם בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 6% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, הכינו תמיסה של מדיום MEM המכיל 10 מיקרומולר של מעכב מחזור התא, AraC.

עבור כל כיסוי, שמור 250 מיקרוליטר מהמדיום הישן בצלחת טרייה של 24 בארות ושאף את השאר. הוסף 250 מיקרוליטר של מדיום MEM רגיל כדי לשטוף את התאים. לאחר מכן, הוסיפו 250 מיקרוליטר של מדיום ישן בחזרה לתאים, ומלאו 250 מיקרוליטר של מדיום המכיל AraC.

בהליך זה, הוסף LME טהור לחמישה מיליליטר של מדיום MEM כדי לתת ריכוז סופי של 150 מילי-מולרי LME. החזר את התמיסה ל- pH 7.4 באמצעות תמיסת חומצה-בסיס. לאחר מכן, סנן אותו סטרילי באמצעות PES 28 מילימטר עם מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר.

לאחר מכן, יש לדלל את תמיסת ה-LME לריכוז של 50 מילי-מולרי בתווך MEM. לאחר מכן, הניחו אותו באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, יחד עם מדיום MEM רגיל לתרביות בקרה. לאחר 10 דקות, הסר 250 מיקרוליטר ממדיום ה-MEM מכל תרבית CGC. לאחר מכן, שמור על המדיה ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, טפל בתאים עם מדיום MEM המכיל פי 2 LME או עם מדיום MEM מחומם מראש ללא LME לתרביות בקרה. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה עם 6% פחמן דו חמצני למשך שעה. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים במדיום MEM טרי שחומם מראש כדי להסיר את המדיה המכילה LME.

לאחר מכן, החלף את מדיום התרבות שנשמר בכמות שווה של מדיום MEM טרי שחומם מראש. לבסוף, דגרו את התרביות ב-6% פחמן דו חמצני לח ב-37 מעלות צלזיוס.