הקמת תרבית תלת-ממדית של תאי גלייה שמקורם במוח חולדה

קחו מיקרו-צלחת עם תרבית דבוקה של תאי גליה שמקורם במוח של חולדה. התרבות מכילה אסטרוציטים, מיקרוגליה ואוליגודנדרוציטים.

הסר את המדיום, דגר עם תמיסת אנזים כדי לנתק את התאים ואז העביר אותם לצינור.

צנטריפוגה והסר את הסופרנטנט עם פסולת תאית. השעו מחדש את התאים במדיום חם.

טריטוראט באמצעות מזרק כדי לפרק גושי תאים ולסנן באמצעות מסננת לקבלת תרחיף חד-תאי.

הוסף ביופולימר הניתן לקישור פוטו-צולב, סוכני קישור צולבים ורכיבי מטריצה חוץ-תאיים.

יוצקים את התערובת לתבנית המחוברת לכיסוי. חשפו את התערובת לאור בעוצמה גבוהה כדי לגרום לקישור צולב, ליצור ג'ל ולעטוף את תאי הגליה.

הסר את התבנית והנח את הכיסויים במיקרופלייט. הוסף מדיום חם ודגר את הג'ל בתנאים פיזיולוגיים.

התאים מתרבים בתוך המטריצה החוץ-תאית התומכת ויוצרים רשת סלולרית, ויוצרים תרבית תלת מימדית של תאי גליה.

24 שעות לפני עטיפת התאים, שאפו את המדיום מתרביות ראשוניות של שבועיים, והוסיפו 1 מיליליטר של מדיום טרי לכל באר. ביום עטיפת התאים, הכינו 12.5 מיליליטר טריפסין מדולל ו -25 מיליליטר בינוני לכל צלחת של 12 בארות, וחממו ל -37 מעלות צלזיוס באמבט מים. לאחר מכן, השתמש בפיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר כדי להוסיף כ-1 מיליליטר של טריפסין מדולל לכל באר של צלחת 12 הבארות.

דוגרים במשך 20 עד 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עד ששכבת התאים המתכנסת מתנתקת מהצלחת. לאחר הדגירה, השתמש בפיפטה של 1 מיליליטר כדי לשחזר את התאים המנותקים, שאמורים להופיע כחתיכה צפה אחת, ולהעביר לצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מיליליטר. מדללים בנפח שווה ערך של בינוני וצנטריפוגה ב -200 פעמים גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר צנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב-10 מיליליטר של מדיום חם. יש לשלש את התאים חמש פעמים עם הפיפטה, ואז לצנטריפוגה שוב ב -200 פעמים גרם למשך שתי דקות. לאחר הסיבוב, שפכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את התאים ב-5 מיליליטר של מדיום חם, והעבירו את התאים לצינור צנטריפוגה חרוטי של 50 מיליליטר.

לאחר מכן, באמצעות מזרק של 10 מיליליטר עם מחט בגודל 18, יש לשלש את תמיסת התא שלוש פעמים ולסנן את התרחיף דרך מסננת תאים של 40 מיקרון לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי חדש. לאחר מכן, אספו 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים, ודללו 1 עד 100 במדיום חם, וספרו את התאים עם מונה תאים אוטומטי.

דגרו את התאים הנותרים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד לשלב האנקפסולציה. חם 12.5 מיליליטר של מדיום נאיבי ו -12.5 מיליליטר של מדיום ממוזג לכל צמח צלחת 12 בארות של הידרוג'לים תלת מימדיים. לאחר מכן, שקלו 7 מיליגרם של HAMA לצמח צלחת 12 בארות, והוסיפו למסנן סטרילי לריכוז של 2% משקל לנפח. יש לסוניק את התמיסה למשך 60 דקות בטמפרטורה של 20 קילו-הרץ עד להמסה מלאה של ה-HAMA.

בזמן סוניקציה, הכינו פתרונות בודדים של 10% הן של TEA והן של NVP. הכינו גם תמיסה של 1 מילי-מולרית של אאוזין ב-1 מיליליטר של PBS סטרילי. לאחר מכן, עבור כל צלחת של 12 בארות, הכינו תערובת סופית של 1.4 1.4 מיליליטר של 1 x 10⁷ תאים, 0.5% HAMA, 20% תערובת למינה בזאלית ב-PBS, 0.1% TEA, 0.1% NVP ו-0.01 מילי-מולרי אאוזין Y.

לאחר ערבוב עדין של התמיסה, השתמש בפיפטה המצוידת בקצה של 1 מיליליטר כדי להוציא 100 מיקרוליטר לכל תבנית PDMS. לאחר מכן, חשוף את הדגימות לנורת LED ירוקה בעוצמה גבוהה בקופסה סגורה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.

חשיפת ה-LED הירוקה של חמש דקות חיונית ליצירת הג'ל התלת מימדי. הצבע האדום שהוצג על ידי האאוזין Y יהפוך לשקוף ויצביע על סיום התגובה.

לאחר מכן, הוסף 1 מיליליטר של מדיה חמה וממוזגת לכל באר של צלחת של 12 בארות; אחוז בכל כיסוי בין האגודל לאצבע המורה והשתמש בפינצטה מעוקלת כדי לקלף לאט את תבנית ה-PDMS מבלי לעקור את הג'ל. מניחים את התבנית לבאר עם מדיום מותנה.

הסרת התבנית היא השלב המאתגר ביותר. יש לעשות זאת בזהירות מירבית כדי למנוע עקירת הג'ל ושבירת הכיסוי. זה עשוי לדרוש תרגול.

לאחר שכל התבניות הועברו לבארות הצלחת, הוסף 1 מיליליטר נוסף של מדיום DMEM/F12 חם לכל באר. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך שבועיים לפני ההדמיה.