טביעת אצבעות של DNA Mycobacterium leprae מתחים באמצעות מספר משתנה טנדם חזור (VNTR) - אורך ניתוח שבר (FLA)
15 ביולי 2011
צרעת, הנגרמת על ידי Mycobacterium leprae, היא עדיין אנדמית במקומות רבים. על מנת ללמוד על התפשטות ומצב של שידור של צרעת, חשוב לקבוע איזה זן של מ leprae נגוע חולה. מספר משתנה של חזרות טנדם (VNTR) הקלדה היא שיטה אחת כזו.
המטרה הכללית של הליך זה היא לפתח טביעת אצבע של DNA המבדילה את mycobacterium leprae, החיידק שאינו ניתן לגידול הגורם לגרבוב, ישירות מדגימות קליניות. DNA חיידקי של M. leprae, שהוצא מביופסיות של מטופלים, מוגבר באמצעות multiplex PCR תוך שימוש בפריימרים פלואורסצנטיים ספציפיים לאזורי VNTR (variable number tandem repeat). לאחר הגברת ה-DNA, מבוצעת אלקטרופורזה קפילרית לצורך ניתוח אורך הפרגמנטים.
הנתונים מנותחים כדי לקבוע את מספר מקטעי ה-DNA מסוג short tandem repeat בכל ਲੋכוס. מכיוון שזנים שונים של EPRI מציגים מספרים שונים של חזרות שוב ושוב (tandem repeats) בכל לוכוס, נתונים ממספר לוכוסים מייצרים טביעות אצבע של DNA ייחודיות, וניתן להקים מאגר נתונים של סוגי זנים של מטופלים באמצעות טכניקה זו.
ניתן לאפיין את מבנה האוכלוסייה, האבולוציה וההעברה של מחלת הליפרה בין חולים בקהילות מוגדרות וברחבי העולם, ובסופו של דבר לספק כלים גנטיים וראיות למיגור המחלה. ניתן להשתמש בשיטה זו למעקב אחר התפשטות הליפרה, לזיהוי מקבצי זיהומים אחרונים ואנשים שנמצאים בסיכון, ולמדידת היעילות של תוכניות בקרה. את הפרוצדורה ידגימו Lee ו-Ron Jensen, חוקרים מהמעבדה שלי, ו-Jason Rivers מהמתקן המרכזי למכשירים שלנו, שיבצעו הפקת DNA מביופסיות קליניות באמצעות ערכה סטנדרטית להפקת DNA של KaiGen.
לאחר השגת ה-DNA, הגדירו אזור עבודה חדש בתוך קבינט PCR נקי. כדי למנוע זיהום של DNA, נגבו את הקבינט ואת סט הפפיטות ב-70% ethanol וחשפו את הקבינט ואת הפפיטות לקרינת UV למשך 15 דקות. לאחר שהקבינט נקי, ניתן להכין את ה-multiplex PCR; עבור כל multiplex PCR משתמשים בארבעה עד חמישה זוגות פריימרים, כאשר פריימר אחד בכל זוג מסומן פלואורסצנטית.
יש לערבב. השתמש במלאי פריימרים בריכוז 10 micromolar שהוכנו ב-te buffer כדי להכין את תערובות הפריימרים; ערבב כמויות שוות של כל הפריימרים הקדמיים (forward) או העליונים בתוך מבחנה אחת, כך שיושג ריכוז סופי של שני micromolar. עבור כל פריימר, הוסף TE buffer במידת הצורך.
במבחנה אחרת, ערבבו את כל הפריימרים ההפוכים (reverse) או התחתונים באותו האופן. לאחר הכנת תערובות הפריימרים, הכינו את תערובת ה-PCR MES. הכינו מפת פלטה המסומנת עם כל הדגימות והביקורות עבור כל דגימה.
התערובת הראשית (master mix) צריכה להכיל 12 µL של KaiGen multiplex PCR mix, שני µL מכל מאגר פריימרים ושני µL של Q solution. ודאו שאתם מכינים כמות מספיקה של תערובת ראשית כדי לכלול בקרות ולפיצוי על אובדן נוזלים בזמן הפעולות עם הפפטה. סבבו את התערובת הראשית בצנטריפוגה למשך זמן קצר.
לאחר מכן, חלקו 18 µL של תערובת מאסטר (master mix) לכל באער של פלטת PCR. כדי למנוע זיהום של דגימות ה-DNA, החליפו כפפות, נגבו וחטאו תא בטיחות ביולוגית נפרד. כפי שנעשה קודם לכן, לאחר חיטוי המנדף, העבירו את הפלטה למנדף זה.
לאחר מכן, הוסיפו 2 µL מדגימת ה-DNA לכל באר המכילה את התערובת הראשית (master mix). הקפידו להשתמש בקצות פיפט עם מסנן למניעת אירוסול כדי למנוע זיהום צולב. אטמו בזהירות את פלטות ה-PCR וסובבו אותן קצרת בcenterY-centrifuge כדי לערבב את התכנים.
לאחר מכן, הניחו את פלטת התגובה בטרמוסייקלר והפעילו את תוכנית ה-PCR עבור הדגימות המוגשות. עבור FLA, הכינו את תמיסת ה-formamide, את ה-master mix, והוסיפו את תוצרי ה-PCR המדוללים למבחנה נקייה; ערבבו 12 µL של תמיסת high dfor amide ו-0.3 µL של gene scan, 500 lid sizing standard עבור כל דגימה לבדיקה. חלקו 12.3 µL מתמיסה זו לכל באער בפלטת תגובה בעלת איכות אופטית של 96 באערים.
עם השלמת ה-PCR, יש לסובב את הפלטה בצנטריפוגה. ודאו שמיקומו של כל דגימה רשום במפת הפלטה. לאחר מכן, בפלטה נפרדת בעלת 96 בארות, העבירו מנורית של 59 µL של מים נקיים מנוקלאז (nuclease free water) לכל בארה, והוסיפו 1 µL מכל תגובת PCR לבארה כדי לדלל את ה-DNA המוגבר ביחס של 1:60.
לאחר שביצעו את דילול ה-DNA, השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי להעביר מיקרוליטר אחד מכל דגימת PCR מדוללת לבאר המתאימה בלוחית המכילה את תמיסת הפורממיד. עם השלמת התוכנית, ניתן לבחון את הדגימות באמצעות אלקטרופורזה סטנדרטית של ג'ל אגרוז כדי לאשר שבשלב זה הוגברו מקטעי ה-DNA בגדלים הצפויים. הדגימות מוכנות לניתוח באמצעות אלקטרופורזה קפילרית פלואורסצנטית בעזרת גנטיקאי-אנלייזר FLA; לפני הניתוח, הוסיפו ספטום ללוחית וסובבו במסנטר באופן קצר כדי להסיר בועות אוויר ולהוריד את הדגימה לתחתית הבאר.
ה-IDE יגרום לדנטורציה כימית של הגדילים, כך שאין צורך בדנטורציה תרמית. הנח את הפלטה במגש הטעינה. השג את תוצר ה-PCR המסומן באמצעות אלקטרופורזה קפילרית, כגון ABBI'S genetic analyzer 31 30 xl.
נתחו את הדגימות באמצעות קפילרית באורך 50 centimeter הממולאת בפולימר pop seven כחומר הפרדה. ה-DNA נודד לעבר קצה הקפילרית, שם לייזר וגלאי מודדים את התוויות הפלואורסצנטיות. פתחו את תוכנת האיסוף של המנתח. יהיה צורך לכייל את המנתח כדי לזהות את כל הצבעים שנעשה בהם שימוש לפני הרצת הדגימות, כולל סטנדרט הגודל. ה-dset ששימש לדגימות אלו הוא ABIs G five. הדגימות מוחדרות באופן אלקטרו-קינטי במתח של 1.6 kilovolts למשך 15 שניות.
הפרידו את הפראגמנטים על ידי הפעלת 15 kilovolts למשך 1800 שניות. זמן הריצה הכולל לכל ריצה הוא כ-45 דקות. עם סיום הריצה, צרו קובצי נתונים עבור כל דגימה.
הקבצים ממוקמים בתיקיית פלטה על ידי תוכנת האיסוף של האנלייזר במיקום שנקבע מראש. הקבצים הם בפורמט FSA. ניתן לנתח נתוני FLA באמצעות תוכנת peak scanner, הזמינה בחינם באתר של Applied Biosystems.
כדי לנתח נתונים, לחצו על start new project, ולאחר מכן על add files. טענו לתוכנה את קובצי הנתונים שנבחרו, כולל הביקורות החיוביות והשליליות. בחרו את הקבצים שנטענו ובצעו להם ניתוח.
התוצאות מוצגות ככרומטוגרם FLA. תקני הגודל מופיעים כפיקים כתומים, בעוד שהפיקים הצבעוניים מייצגים את דגימות ה-DNA החיידקי עבור כל לוקוס שנותח בדגימה; לחצו על פיק כדי לקבוע את גודלו בזוגות בסיסים. בשל סינתזת החלקה של גדיל (slip strand synthesis) על ידי DNA polymerase, עבור חלק מלוכסי המיקרו-לוח (microsatellite loci) יזוהה מקבץ של פיקים באותו צבע.
במקרים אלו, הפסגה הנבחרת היא בדרך כלל זו בעלת האמפליטודה הגבוהה ביותר. השוו את גדלי הפרגמנטים בכל דגימה לגודל של הביקורת החיובית כדי לקבוע כמה מקטעי חזרות שורות (tandem repeat) קיימים עבור כל אלל שנבדק, ורשמו את הנתונים בגיליון אלקטרוני של Excel לצורך ניתוח נוסף. באיור זה מוצג טביעת האצבע של ה-DNA של בידודים משבעה מטופלים השייכים לשלוש משפחות שונות מאותו כפר, ומספר החזרות השורות עבור כל לוקוס פולימורפי שנותח מצוין בתמונה.
נתונים אלו מצביעים על כך ששני בני משפחה be נגועים באותו זן, בעוד שבן משפחה אחד נגוע בזן נפרד. בני משפחה C ככל הנראה נגועים באותו זן, וכך גם בני משפחה A. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה כיצד לשלב באופן שגרתי multiplex PCR ואנליזה של אורך מקטעים כדי להשיג טביעות אצבע של V-N-T-R-D-N-A עבור חולי leprosy הפונים למרפאות.
אלו הם כלים מולקולריים חדשניים המשלימים את האפידמיולוגיה הקונבנציונלית לצורך בקרה של מחלת הצרעת.
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בפיתוח שיטה לטביעת אצבע של DNA עבור Mycobacterium leprae, החיידק הגורם למחלת ה leprosy, תוך שימוש בדגימות קליניות. באמצעות שימוש בטיפוס של חזרות שניות של מספרים משתנים (VNTR), החוקרים שואפים לעקוב אחר התפשטותה וההדבקה של מחלת ה leprosy.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- גנטיקה
- מחלות זיהומיות
רקע
- מחלת הצרעת נגרמת על ידי Mycobacterium leprae ונותרה אנדמית באזורים שונים.
- הבנת זן ה-M. leprae היא קריטית למעקב אחר זיהומים.
- טיפוס VNTR מספק שיטה להבחנה בין זנים שונים.
- טכניקה זו יכולה לסייע במיגור הצרעת באמצעות מעקב טוב יותר אחר ההדבקה.
מטרת המחקר
- ליצירת טביעת אצבע ייחודית של DNA עבור M. leprae מדגימות קליניות.
- לניתוח מבנה האוכלוסייה ודינמיקת ההדבקה של הצרעת.
- לזיהוי מקבצים של זיהומים אחרונים ואנשים הנמצאים בסיכון.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיצוי DNA מביופסיות של מטופלים באמצעות ערכה למיצוי DNA של KaiGen.
- הגברה באמצעות Multiplex PCR עם פריימרים פלואורסצנטיים המכוונים לאתרי VNTR.
- אלקטרופורזה קפילרית לניתוח אורך הפסגמים של ה-DNA שהוגבר.
- ניתוח נתונים ליצירת טביעות אצבע ייחודיות של DNA לצורך זיהוי זנים.
תוצאות עיקריות
- הגברה מוצלחת של DNA של M. leprae מדגימות קליניות.
- יצירת מאגר נתונים של סוגי זנים המבוסס על אנליזת VNTR.
- אפיון של דפוסי העברה של מחלת הlecticra בקהילות מוגדרות.
- ראיות התומכות בשימוש בכלים גנטיים למאמצי מיגור הlecticra.
מסקנות
- טיפוס VNTR הוא שיטה יעילה למעקב אחר זני מחלה של leprosy.
- טכניקה זו יכולה להגביר את ההבנה של העברת ה-leprosy.
- היא מספקת תובנות בעלות ערך עבור התערבויות בבריאות הציבור שמטרתן לשלוט ב-leprosy.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טביעת אצבע של DNA של Mycobacterium leprae באמצעות ניתוח אורך מקטעי VNTR מאפשרת בידול מדויק של זנים ישירות מדגימות קליניות, ובכך היא פותרת את האתגר הכרוך בפתוגנים שאינם ניתנים לגידול. גישה מולקולרית זו מגבירה את הביטחון החזוי במעקב אחר דינמיקת ההדבקה ותומכת בהחלטות מותאמות סיכון בניהול פורטפוליו של מחלות זיהומיות. שילוב של כלים גנטיים אלה בצינורי מחקר ופיתוח מחזק את המעקב האפידמיולוגי ומנחה אסטרטגיות התערבות ממוקדות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מבנה אוכלוסיית הפתוגן ונתיבי ההעברה.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבחנה בין חתימות גנטיות ספציפיות לזן.
- מסייע בביסוס הביטחון החזוי בקישור בין מקרים קליניים לאפידמיולוגיה מולקולרית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין בדיקות טביעת אצבע של DNA שעברו תיקוף לצורך תהליכי עבודה אפידמיולוגיים המשכיים.
- מסטנדרטי את תהליכי ה-multiplex PCR ואלקטרופורזה קפילרית לקבלת תוצאות הדירות.
- מאפשר ניתוח רחב-היקפי וניתן להרחבה של דגימות קליניות וניסיוניות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים בין טיפוס מאב (strain typing) מולקולרי לבין מחקרים של העברת מחלות באוכלוסיות מוגדרות.
- מספק רציפות מניתוח דגימות קליניות למעקב ברמת האוכלוסייה.
- תומך בקידום התערבויות לבריאות הציבור המותאמות לרמת הסיכון, על בסיס ראיות גנטיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי של מחלות זיהומיות, מרגע רכישת הדגימה הקלינית, דרך ניתוח מולקולרי ועד לפירוש אפידמיולוגי.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת היפותזות על נתיבי הדבקה ומגוון זנים באמצעות דגימות ישירות ממטופלים.
- סריקה: מספק פרופילי VNTR כמותיים הניתנים לשחזור לצורך השוואה חסונה של זנים.
- אנליטיקה: מספק נתוני אורך פרגמנטים וזיהוי אללים לצורך ניתוח סטטיסטי של מבנה האוכלוסייה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין טביעות אצבע מולקולריות לנתונים קליניים ואפידמיולוגיים לצורך הפקת תובנות יישומיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לצורך מעקב שוטף וחקירת התפרצויות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במיפוי העברה ובייחוס זנים.
- ערך תפעולי: מייצר סטנדרטיזציה של זרימות עבודה עבור multiplex PCR וניתוח מקטעים בין צוותים שונים.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות של go/no-go עבור אסטרטגיות התערבות והקצאת משאבים.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של תוכניות מעקב ובקרה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה מולקולרית ובמכשור לניתוח מקטעים.
- נדרש גישה למערכות אלקטרופורזה קפילרית ותוכנה מאומתת לפירוש נתונים.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים כדי להבטיח שחזור ושלמות הנתונים.
- ניתן להתאמה לסוגים שונים של דגימות קליניות וניסיוניות עם בקרות מתאימות.
- תלוי באיכות ה-DNA המופק ובתכנון הפריימרים להצלחת ה-multiplex PCR.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:39
Amplification of Bacterial DNA Using Multiplex PCR
4:05
Fragment Length Analysis: Preparation of Samples and Electrophoresis
6:53
Analysis of Fragment Length Results
8:24
Fragment Length Analysis for Leprosy Patients in the Philippines
9:04
Conclusion
