Name: טביעת אצבעות של DNA Mycobacterium leprae מתחים באמצעות מספר משתנה טנדם חזור (VNTR) - אורך ניתוח שבר (FLA) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: למד ליצור טביעת אצבעות DNA של Mycobacterium leprae באמצעות VNTR ו-FLA מדגימים קליניים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר שרשראות זיהום הצרעת וזיהוי אנשים בסיכון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המימון ניתן על ידי NIH / NIAID מענק RO1-AI-63457 ו ערה להעניק תוספת RO1-AI-63457 S1. אנו מכירים את התרומה של כל חברי בעבר ובהווה של הקבוצה מעבדה ומשתפי פעולה.

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+of+leprosy+for+control+programmes%5BTitle%5D)+AND+%22Technical+Report+Series%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy of leprosy for control programmes.</a> Technical Report Series. 675, 18-22 (1982).</li>
<li>Cole, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+gene+decay+in+the+leprosy+bacillus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Massive gene decay in the leprosy bacillus.</a> Nature. 409, 1007-1011 (2001).</li>
<li>Leproma Web Server. Leproma Web Server [Internet]. , Available from: http://genolist.pasteur.fr/Leproma/ (2004).</li>
<li>Groathouse, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Polymorphic+Loci+for+Molecular+Typing+of+Strains+of+Mycobacterium+leprae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple Polymorphic Loci for Molecular Typing of Strains of Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 42, 1666-1672 (2004).</li>
<li>Young, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Short+Tandem+Repeat+Sequences+to+Study+Mycobacterium+leprae+in+Leprosy+Patients+in+Malawi+and+India%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science%3A+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Use of Short Tandem Repeat Sequences to Study Mycobacterium leprae in Leprosy Patients in Malawi and India.</a> Public Library of Science: Neglected Tropical Diseases. 2, E214-E214 (2008).</li>
<li>Monot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+Variable-Number+Tandem+Repeats+Appropriate+for+Genotyping+Mycobacterium+leprae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Are Variable-Number Tandem Repeats Appropriate for Genotyping Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 46, 2291-2297 (2008).</li>
<li>Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Variable+Number+Tandem-Repeat+Genotyping+for+Mycobacterium+leprae+Clinical+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid Variable Number Tandem-Repeat Genotyping for Mycobacterium leprae Clinical Specimens.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 1757-1766 (2009).</li>
<li>Weng, X. iaoman <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Distribution+of+Mycobacterium+leprae+Genotypes+in+a+Region+of+High+Leprosy+Prevalence+in+China%3A+a+3-Year+Molecular+Epidemiological+Study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification and Distribution of Mycobacterium leprae Genotypes in a Region of High Leprosy Prevalence in China: a 3-Year Molecular Epidemiological Study.</a> J. of Clinical Microbiology. 45, 1728-1734 (2007).</li>
<li>Weng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+leprosy+in+Qiubei+County%2C+Yunnan%2C+China%3A+Insights+from+an+eight+year+molecular+epidemiology+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Infection%2C+Genetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Transmission of leprosy in Qiubei County, Yunnan, China: Insights from an eight year molecular epidemiology investigation.</a> Infection, Genetics and Evolution. , (2010).</li>
<li>Sakamuri, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population-Based+Molecular+Epidemiology+of+Leprosy+in+Cebu%2C+Philippines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Population-Based Molecular Epidemiology of Leprosy in Cebu, Philippines.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 2844-2854 (2009).</li>
<li>Fontes, A. N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+of+Mycobacterium+leprae+isolates+from+Brazilian+leprosy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Leprosy+Review%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity of Mycobacterium leprae isolates from Brazilian leprosy patients.</a> Leprosy Review. 80, 302-315 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אוסף דגימות עור מחולים צרעת דורש רופאים מיומנים או טכנאים עובדים במרפאות העור. עובדי המעבדה טיפול דגימות אלה צריכים להקפיד ללבוש חלוקי מעבדה, כפפות ללבוש עין מגן לעבודה בארון ביו בטיחות בעת הטיפול בדגימות של רקמות נגועות אדם או ארמדיל. חיטוי של משטחים וכלים גם קריטי. עבודה ממשלה נקייה, ביו בטוח סטרילי חשוב למניעת זיהום של דגימות DNA. מיצוי DNA הפכה קלה יחסית הודות לפיתוח של ערכות חילוץ מחברות כמו Qiagen. כיווני חייב להיות אחריו בזהירות. כל הדגימות צריך להישמר קר כאשר אינו בשימוש. הימנע חוזרות ונשנות, שינויי טמפרטורה קיצוניים של הדגימות. Primers DNA המשמשים בעבודה זו ניתן להזמין מחברות שונות אשר צוטטו ברשימת הפניות ספרות בסוף מאמר זה. יש להקפיד לעבוד עם primers בסביבת ה-DNA בחינם על מנת למנוע זיהום. Primers לבוא כמו אבקה יבשה והוא חייב להיות מעורב עם TE ו מדולל לריכוז 100μM, מופרדים מכן לתוך כמויות קטנות (איור 2 א). פתרונות עבודה של primers הם מדולל יותר לריכוזים 10μM. שוב, אין להשתמש דגימות DNA באזורים / ברדסים שם primers משמשים ומוכן. מוצרי ה-PCR צריך גם להישמר קר כאשר אינו בשימוש. הכנה 3% agarose ג&#39;ל ייתן יותר הלהקה ההפרדה DNA, אבל לוקח יותר זמן לרוץ. לענין איכותי בלבד, 2% מספיקה בדרך כלל. פתרון Ethidium ברומיד המשמש מכתים את ה-DNA בשנת agarose ג&#39;ל הוא genotoxin פעיל מאוד, כי הוא נספג דרך העור. טפל זה הפתרון ג&#39;ל מוכתם אותו באמצעות בזהירות רבה, ותמיד להיות בטוח ללבוש כפפות. לשטוף ידיים ביסודיות לאחר כל טיפול דגימות DNA או חומרים ברומיד ethidium. השלך פתרון מכתים ethidium ברומיד, לרחוץ ג&#39;לים בהתאם להנחיות מוסדיים. ג&#39;ל אינם נדרשים באופן שגרתי; שלב זה אפשר לחסל אחת השיטות FLA הוקמו. זה זמן רב מגיב. הפתרון לפוראמיד המשמשים להכנת דגימות FLA הוא גם רעיל מאוד ויש לטפל בזהירות. רחצו ידיים לאחר השימוש בו. השלך אותו בעקבות הנחיות מוסדיים. קריאת התוצאות של FLA באמצעות תוכנת סורק שיא יכול להיות מאתגר. סט בסיסי של שיחות האלל (מספר חזרות טנדם) פותחה על CSU (לוחות 4-7). (יצוין כי לוחות 4-7 לא יכול להיות הכל כלול. כמו זנים אחרים של M. leprae נלמדים, אללים עם מספרים להעתיק מחוץ טווחי הרשומים ניתן למצוא.) אתגר אחד מסוים כרוך פסגות &quot;לגמגם&quot;. אלו הן משפחות של פסגות, במיוחד של STRs כי רק לערב 2-3 זוג בסיס חוזר, כגון (ת&quot;א) 10. לפעמים בחירה נכונה שיא לקרוא קשה (איור 7). באיור זה, שיא שליטה חיובית 190 נ&quot;ב הוא שיא הראשי. פיקס נמוך בגובה כי הם 2, 4 או אפילו 6 זוגות בסיסים גדולים יותר או קטנים יותר מאשר השיא העיקריים הם בשם &quot;פסגות לגמגם.&quot; A-עוקב יכול גם לגרום לבלבול. A-עוקב מתואר בתחילת הטקסט באיור 8. לבסוף, אם PCR מוצרים נפוצים מאוד הדגימות, פסגות עשויה להופיע עם ספייק כפול. במקרה זה, לקרוא למרכז של הטופס שיא. (ראה תרשים 6, החולה 6.) ניהול נתונים יכולה להיות משימה קשה עבור סוג זה של עבודה. חשוב לתעד כל מידע רלוונטי עבור כל הניסויים, כגון: תאריך של משימה או נוהל, מפעיל, רצועה / צלחת מפות, הזמנות FLA, תנאי PCR ומתכונים, תאריכי ג&#39;לים תצלומים, טמפרטורות האחסון, דילולים תבנית ה-DNA, FLA אחסון קבצים אלקטרוניים מיקומים, וכו &#39;ארגון טוב וניהול נתונים יכול לחסוך שעות של זמן בילה מחפש חלקים מסוימים של מידע בעתיד. העבודה במעבדה המתואר כאן נמשך כבר מספר שנים באוניברסיטת קולורדו ו במקומות אחרים ברחבי העולם. תמונה גדולה של מה כל הנתונים שנאספו באמצעות ואיך זה יכול להיות שימוש עתידי מתחיל להתגלות. איורים 10A ו - 10B להדגים כיצד אלה טביעות DNA יכול לשמש כדי להבדיל מ שונות leprae זנים בין המדינות (10A) או אפילו בין משפחות (10 ב). המשפחה והקהילה המקרים קשור הוכחו נושאים מ leprae סוגי זן דומה או זהה VNTR. התקווה היא כי זה עשוי להיות אפשרי להשיג תובנה נוספת במצב (ים) של שידור צרעת כך מערכת לגילוי מוקדם של רשתות שידור עשוי להיות מפותח עבור אותם אנשים חודשלא בסיכון, וכי טיפול תרופתי מרפא יכולים להתחיל לפני נזק נוירולוגי קבוע עור נעשה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> דם DNeasy וקיט רקמות </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td><td></td></tr><tr><td> Multiplex PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 206143 </td><td></td></tr><tr><td> ה-DNA primers </td><td> שונים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarose ג&#39;ל </td><td> שונים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> או 5x 6x טוען ג&#39;ל הצפת </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> B7021S </td><td> זמין כדי להפוך * משלך מתכונים </td></tr><tr><td> Ethidium פתרון ברומיד </td><td> שונים </td><td></td><td> מדולל של קון. </td></tr><tr><td> Hi-Di לפוראמיד פתרון </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311320 </td><td></td></tr><tr><td> ג&#39;ין סריקה -500 ליז </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4322682 </td><td></td></tr></tbody></table> <a href="http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html">* Http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html</a> <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> ציוד </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> 2 מקררים </td><td> 4 ° C: 1 עבור דגימות DNA, 1 עבור primers ו ריאגנטים Multiplex </td></tr><tr><td> 1 מיקרוגל </td><td> או דרך מתאים לחימום agarose ומים כדי להפוך ג&#39;לים </td></tr><tr><td> 1 החיטוי </td><td> או סיר לחץ לעיקור חומרים </td></tr><tr><td> מכונת ה-PCR </td><td> Thermocycler </td></tr><tr><td> 2 סטים של pipettes </td><td> 0.5-10 μl, 10-100 μl, 20-200 μl, 1000 להגדיר μl 1 עבור primers, 1 להגדיר עבור ה-DNA </td></tr><tr><td> ג&#39;ל אלקטרופורזה תיבת הצוללת </td><td> עם טפסים מסרקים עבור הכנת ג&#39;ל. </td></tr><tr><td> אספקת החשמל אלקטרופורזה </td><td> עם כבלים לחיבור תיבת ג&#39;ל </td></tr><tr><td> מחממים לחסום </td><td> עבור Eppendorf צינורות </td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> עבור צינורות Eppendorf / רצועות </td></tr><tr><td> אלקטרופורזה מערכת נימית (מנתח גנטי) </td><td> או גישה למוסד כי ניתן לבצע את הניתוח הזה </td></tr><tr><td> פלסטיקה </td><td> פנויה אירוסול פיפטה טיפים, Eppendorf צינורות, רצועות 8-היטב, צלחות 96-טוב, כמה איכות אופטית </td></tr><tr><td> מחשב עם חיבור לאינטרנט </td><td></td></tr></tbody></table>

טביעת אצבעות של dna mycobacterium leprae מתחים באמצעות מספר משתנה טנדם חזור (vntr) - אורך ניתוח שבר (fla)

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

המחקר של השידור של הצרעת הוא קשה במיוחד מאחר הסוכן סיבתי, Mycobacterium leprae, לא יכול להיות מתורבת במעבדה. המקורות רק של חיידקים הם מטופלים צרעת, ארמדילים נגוע בניסוי ועכברים בעירום. לכן, רבים מן השיטות באפידמיולוגיה מודרנית אינם זמינים עבור המחקר של צרעת. למרות תוכנית התרופה נרחב העולמי לטיפול בצרעת מיושם על ידי ארגון הבריאות העולמי 1, צרעת נשאר אנדמי במדינות רבות עם כ 250,000 מקרים חדשים בכל שנה. 2 מ &#39;שלמה leprae הגנום כבר ממופה 3,4 ו לוקוסים רבים זוהו חזרו מקטעים של 2 או יותר זוגות בסיסים (נקרא מיקרו minisatellites). 5 זנים קלינית של מ &#39; leprae עשוי להשתנות במספר מגזרים טנדם חוזרות ונשנות (חזרות טנדם קצרות, STR) בשעה שרבים לוקוסים אלו. 5,6,7 מספר משתנה במקביל לחזור (VNTR) 5 ניתוח נעשה שימוש כדי להבחין בין זנים שונים של החיידקים הצרעת. חלק מהאתרים נראים יציבים יותר מאחרים, מראה וריאציה פחות במספרים חוזרים, בעוד אחרים נראים לשנות במהירות רבה יותר, לפעמים באותו חולה. למרות ההשתנות של VNTRs מסוים הביא את שאלות לגבי התאמתם הקלדה זן 7,8,9, הנתונים מראים כי ניתוח המתעוררים לוקוסים מרובים, שהם מגוונים היציבות שלהם, יכול לשמש ככלי אפידמיולוגי יקר. מספר מוקד VNTR ניתוח (MLVA) 10 נעשה שימוש כדי ללמוד את תורת האבולוציה צרעת והעברת במספר מדינות כולל סין 11,12, 8 מלאווי, פיליפינים 10,13, 14 ו ברזיל. MLVA כרוך שלבים מרובים. ראשית, ה-DNA חיידקי מופק יחד עם ה-DNA המארח רקמה ביופסיות עור קליני או חריץ מריחות (SSS). 10 לוקוסים הרצוי ואז הם מוגבר באמצעות תגובת שרשרת פולימרז (PCR) מ-DNA המחולץ. Primers fluorescently שכותרתו עבור לוקוסים שונים 4-5 משמשים לכל תגובה, עם 18 לוקוסים להיות מוגבר בסך של ארבע תגובות. 10 המוצרים PCR עשוי להיות נתון ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose כדי לוודא את נוכחותו של המגזרים ה-DNA הרצוי, ולאחר מכן הגישה לניתוח פלורסנט אורך קטע (FLA) באמצעות אלקטרופורזה נימי. דנ&quot;א ארמדיל passaged חיידקים עם מספר ידוע של עותקים חוזרים עבור כל מוקד משמש כביקורת חיובית. Chromatograms FLA נבחנים אז באמצעות תוכנה סורק שיא אורך קטע מומר מספר העותקים VNTR (אלל). לבסוף, haplotypes VNTR מנותחים על דפוסים בשילוב עם נתונים קליניים המטופל יכול לשמש כדי לעקוב אחר התפלגות סוגי המתח.

צרעת, הנגרמת על ידי<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt;, היא עדיין אנדמית במקומות רבים. על מנת ללמוד על התפשטות ומצב של שידור של צרעת, חשוב לקבוע איזה זן של<em&gt; מ leprae</em&gt; נגוע חולה. מספר משתנה של חזרות טנדם (VNTR) הקלדה היא שיטה אחת כזו.

טביעת אצבעות של DNA Mycobacterium leprae מתחים באמצעות מספר משתנה טנדם חזור (VNTR) - אורך ניתוח שבר (FLA)

חקר ההעברה של מחלת הtextupרה הוא קשה במיוחד מכיוון שהגורם למחלה, *Mycobacterium leprae*, אינו ניתן לגידול בתרבית במעבדה.

המטרה הכללית של הליך זה היא לפתח טביעת אצבע של DNA המבדילה את mycobacterium leprae, החיידק שאינו ניתן לגידול הגורם לגרבוב, ישירות מדגימות קליניות. DNA חיידקי של M. leprae, שהוצא מביופסיות של מטופלים, מוגבר באמצעות multiplex PCR תוך שימוש בפריימרים פלואורסצנטיים ספציפיים לאזורי VNTR (variable number tandem repeat). לאחר הגברת ה-DNA, מבוצעת אלקטרופורזה קפילרית לצורך ניתוח אורך הפרגמנטים.הנתונים מנותחים כדי לקבוע את מספר מקטעי ה-DNA מסוג short tandem repeat בכל ਲੋכוס. מכיוון שזנים שונים של EPRI מציגים מספרים שונים של חזרות שוב ושוב (tandem repeats) בכל לוכוס, נתונים ממספר לוכוסים מייצרים טביעות אצבע של DNA ייחודיות, וניתן להקים מאגר נתונים של סוגי זנים של מטופלים באמצעות טכניקה זו.ניתן לאפיין את מבנה האוכלוסייה, האבולוציה וההעברה של מחלת הליפרה בין חולים בקהילות מוגדרות וברחבי העולם, ובסופו של דבר לספק כלים גנטיים וראיות למיגור המחלה. ניתן להשתמש בשיטה זו למעקב אחר התפשטות הליפרה, לזיהוי מקבצי זיהומים אחרונים ואנשים שנמצאים בסיכון, ולמדידת היעילות של תוכניות בקרה. את הפרוצדורה ידגימו Lee ו-Ron Jensen, חוקרים מהמעבדה שלי, ו-Jason Rivers מהמתקן המרכזי למכשירים שלנו, שיבצעו הפקת DNA מביופסיות קליניות באמצעות ערכה סטנדרטית להפקת DNA של KaiGen.לאחר השגת ה-DNA, הגדירו אזור עבודה חדש בתוך קבינט PCR נקי. כדי למנוע זיהום של DNA, נגבו את הקבינט ואת סט הפפיטות ב-70% ethanol וחשפו את הקבינט ואת הפפיטות לקרינת UV למשך 15 דקות. לאחר שהקבינט נקי, ניתן להכין את ה-multiplex PCR; עבור כל multiplex PCR משתמשים בארבעה עד חמישה זוגות פריימרים, כאשר פריימר אחד בכל זוג מסומן פלואורסצנטית.יש לערבב. השתמש במלאי פריימרים בריכוז 10 micromolar שהוכנו ב-te buffer כדי להכין את תערובות הפריימרים; ערבב כמויות שוות של כל הפריימרים הקדמיים (forward) או העליונים בתוך מבחנה אחת, כך שיושג ריכוז סופי של שני micromolar. עבור כל פריימר, הוסף TE buffer במידת הצורך.במבחנה אחרת, ערבבו את כל הפריימרים ההפוכים (reverse) או התחתונים באותו האופן. לאחר הכנת תערובות הפריימרים, הכינו את תערובת ה-PCR MES. הכינו מפת פלטה המסומנת עם כל הדגימות והביקורות עבור כל דגימה.התערובת הראשית (master mix) צריכה להכיל 12 µL של KaiGen multiplex PCR mix, שני µL מכל מאגר פריימרים ושני µL של Q solution. ודאו שאתם מכינים כמות מספיקה של תערובת ראשית כדי לכלול בקרות ולפיצוי על אובדן נוזלים בזמן הפעולות עם הפפטה. סבבו את התערובת הראשית בצנטריפוגה למשך זמן קצר.לאחר מכן, חלקו 18 µL של תערובת מאסטר (master mix) לכל באער של פלטת PCR. כדי למנוע זיהום של דגימות ה-DNA, החליפו כפפות, נגבו וחטאו תא בטיחות ביולוגית נפרד. כפי שנעשה קודם לכן, לאחר חיטוי המנדף, העבירו את הפלטה למנדף זה.לאחר מכן, הוסיפו 2 µL מדגימת ה-DNA לכל באר המכילה את התערובת הראשית (master mix). הקפידו להשתמש בקצות פיפט עם מסנן למניעת אירוסול כדי למנוע זיהום צולב. אטמו בזהירות את פלטות ה-PCR וסובבו אותן קצרת בcenterY-centrifuge כדי לערבב את התכנים.לאחר מכן, הניחו את פלטת התגובה בטרמוסייקלר והפעילו את תוכנית ה-PCR עבור הדגימות המוגשות. עבור FLA, הכינו את תמיסת ה-formamide, את ה-master mix, והוסיפו את תוצרי ה-PCR המדוללים למבחנה נקייה; ערבבו 12 µL של תמיסת high dfor amide ו-0.3 µL של gene scan, 500 lid sizing standard עבור כל דגימה לבדיקה. חלקו 12.3 µL מתמיסה זו לכל באער בפלטת תגובה בעלת איכות אופטית של 96 באערים.עם השלמת ה-PCR, יש לסובב את הפלטה בצנטריפוגה. ודאו שמיקומו של כל דגימה רשום במפת הפלטה. לאחר מכן, בפלטה נפרדת בעלת 96 בארות, העבירו מנורית של 59 µL של מים נקיים מנוקלאז (nuclease free water) לכל בארה, והוסיפו 1 µL מכל תגובת PCR לבארה כדי לדלל את ה-DNA המוגבר ביחס של 1:60.לאחר שביצעו את דילול ה-DNA, השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי להעביר מיקרוליטר אחד מכל דגימת PCR מדוללת לבאר המתאימה בלוחית המכילה את תמיסת הפורממיד. עם השלמת התוכנית, ניתן לבחון את הדגימות באמצעות אלקטרופורזה סטנדרטית של ג'ל אגרוז כדי לאשר שבשלב זה הוגברו מקטעי ה-DNA בגדלים הצפויים. הדגימות מוכנות לניתוח באמצעות אלקטרופורזה קפילרית פלואורסצנטית בעזרת גנטיקאי-אנלייזר FLA; לפני הניתוח, הוסיפו ספטום ללוחית וסובבו במסנטר באופן קצר כדי להסיר בועות אוויר ולהוריד את הדגימה לתחתית הבאר.ה-IDE יגרום לדנטורציה כימית של הגדילים, כך שאין צורך בדנטורציה תרמית. הנח את הפלטה במגש הטעינה. השג את תוצר ה-PCR המסומן באמצעות אלקטרופורזה קפילרית, כגון ABBI'S genetic analyzer 31 30 xl.נתחו את הדגימות באמצעות קפילרית באורך 50 centimeter הממולאת בפולימר pop seven כחומר הפרדה. ה-DNA נודד לעבר קצה הקפילרית, שם לייזר וגלאי מודדים את התוויות הפלואורסצנטיות. פתחו את תוכנת האיסוף של המנתח. יהיה צורך לכייל את המנתח כדי לזהות את כל הצבעים שנעשה בהם שימוש לפני הרצת הדגימות, כולל סטנדרט הגודל. ה-dset ששימש לדגימות אלו הוא ABIs G five. הדגימות מוחדרות באופן אלקטרו-קינטי במתח של 1.6 kilovolts למשך 15 שניות.הפרידו את הפראגמנטים על ידי הפעלת 15 kilovolts למשך 1800 שניות. זמן הריצה הכולל לכל ריצה הוא כ-45 דקות. עם סיום הריצה, צרו קובצי נתונים עבור כל דגימה.הקבצים ממוקמים בתיקיית פלטה על ידי תוכנת האיסוף של האנלייזר במיקום שנקבע מראש. הקבצים הם בפורמט FSA. ניתן לנתח נתוני FLA באמצעות תוכנת peak scanner, הזמינה בחינם באתר של Applied Biosystems.כדי לנתח נתונים, לחצו על start new project, ולאחר מכן על add files. טענו לתוכנה את קובצי הנתונים שנבחרו, כולל הביקורות החיוביות והשליליות. בחרו את הקבצים שנטענו ובצעו להם ניתוח.התוצאות מוצגות ככרומטוגרם FLA. תקני הגודל מופיעים כפיקים כתומים, בעוד שהפיקים הצבעוניים מייצגים את דגימות ה-DNA החיידקי עבור כל לוקוס שנותח בדגימה; לחצו על פיק כדי לקבוע את גודלו בזוגות בסיסים. בשל סינתזת החלקה של גדיל (slip strand synthesis) על ידי DNA polymerase, עבור חלק מלוכסי המיקרו-לוח (microsatellite loci) יזוהה מקבץ של פיקים באותו צבע.במקרים אלו, הפסגה הנבחרת היא בדרך כלל זו בעלת האמפליטודה הגבוהה ביותר. השוו את גדלי הפרגמנטים בכל דגימה לגודל של הביקורת החיובית כדי לקבוע כמה מקטעי חזרות שורות (tandem repeat) קיימים עבור כל אלל שנבדק, ורשמו את הנתונים בגיליון אלקטרוני של Excel לצורך ניתוח נוסף. באיור זה מוצג טביעת האצבע של ה-DNA של בידודים משבעה מטופלים השייכים לשלוש משפחות שונות מאותו כפר, ומספר החזרות השורות עבור כל לוקוס פולימורפי שנותח מצוין בתמונה.נתונים אלו מצביעים על כך ששני בני משפחה be נגועים באותו זן, בעוד שבן משפחה אחד נגוע בזן נפרד. בני משפחה C ככל הנראה נגועים באותו זן, וכך גם בני משפחה A. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה כיצד לשלב באופן שגרתי multiplex PCR ואנליזה של אורך מקטעים כדי להשיג טביעות אצבע של V-N-T-R-D-N-A עבור חולי leprosy הפונים למרפאות.אלו הם כלים מולקולריים חדשניים המשלימים את האפידמיולוגיה הקונבנציונלית לצורך בקרה של מחלת הצרעת.

dna-fingerprinting-mycobacterium-leprae-strains-using-variable-number

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מציגים גישה דגימה פולשנית ביעילות לאסוף דגימות שיער של יונקים קטנים חמקמק, כפי שמוצג על pika האמריקאי. אנו מדגימים את השירות של שיטה זו על ידי מיצוי דנ"א של השיער שנדגמו הגברה מספר סוגים של סמנים מולקולריים נפוץ לימודי האקולוגיה ושימור חיות בר.

שיער פולשנית דגימה טכניקה לקבל DNA באיכות גבוהה מ יונקים קטנים החמקמק

מקור: גולה, ס. ואחרים. ניתוח חוזר של מספר משתנה רב-לוקוס של החיידק הפתוגני לדג Yersinia ruckeri באמצעות Multiplex PCR ואלקטרופורזה קפילרית. J. Vis. Exp. (2019).הסרטון הזה מדגים את ההליך להפרדת אמפליקונים חוזרים עם מספר משתנה (VNTR) המתויגים פלואורסצנטית, שמקורם בחיידק פתוגני לדגים, תוך שימוש באלקטרופורזה קפילרית ליצירת פרופילי אלקטרופרוגרמה ספציפיים לגודל לזיהוי חיידקים.

זיהוי פתוגנים לדגים באמצעות ניתוח חוזרות משתנה (VNTR)

Microarray הגברה משלב הכלאת הגברה וmicroarray PCR אסימטרי לתוך תא בודד, אשר מייעל באופן משמעותי את זרימת עבודה microarray למשתמש הקצה. פישוט זרימת העבודה microarray הוא צעד ראשון הכרחי ליצירת אבחון מבוסס microarray שניתן להשתמש באופן שיגרתי בסביבות נמוכים יותר משאבים.

הוכחת סמים רבים עמידים<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; Microarray ההגברה

אנו מדווחים על הליך תמציתי של הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) בבלוטת המין ובעוברים של Caenorhabditis elegans לצורך התבוננות וכימות רצפים חוזרים. צפינו וכימתנו בהצלחה שני רצפים חוזרים שונים, חזרות טלומרים ותבנית של התארכות חלופית של טלומרים (TALT).

תצפית כימות הטלומרים ו רצפים חוזרים קרינה באמצעות<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) עם PNA בדיקות ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

שרשרת פולימראז משופר שיטת פולימורפיזם תגובת הגבלה שבר אורך עבור genotyping מיני נפוחיתיים ידי ספקטרומטריית נוזלי כרומטוגרפיה / מסה מתוארת. טור מונולית סיליקה הפוכה פאזיים מועסק להפרדת amplicons מתעכל. שיטה זו יכולה להבהיר את המוני monoisotopic של oligonucleotides, אשר הוא כלי שימושי לזיהוי רכב בסיס.

שרשרת פולימראז משופר אורך קטע התגובה הגבלת Genotyping פולימורפיזם של נפוחיתיים רעילים ידי נוזלי כרומטוגרפיה / ספקטרומטריית מסה

במאמר זה, פרוטוקול מפורט לכימות אורך הטלומרים באמצעות ניתוח מסוף שונה מגבלה ניתוח נדון המספק מדידה ישירה ויעילה ישירה של אורך הטלומרים. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מקורות התא של DNA עבור כימות אורך הטלומרים.

שינוי מסוף הגבלת שבירת ניתוח לכימות אורך הטלומרים באמצעות הכלאה ב-ג&#39;ל

הטיפול בדו משתני משתנה מספר לוקוס-repeat (MLVA) המוצג כאן מאפשר מחקר ברזולוציה גבוהה, חזק ונייד של החיידק הפתוגני של הדג. החל מתרבויות טהורות, היישום משתמש ב-PCR מולטיפלקס ובאלקטרופורזה קפילר כדי לייצר פרופילי MLVA 10-הבסים ליישומי מטה.

משתנה רב-לוקוס-ניתוח חוזר של מספר מחזור של הדג -חיידק הפתוגניים באמצעות מולטיפלקס ואלקטרופורזה קפיסימית

כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט כדי ליצור פרופילי טביעת אצבע DNA על ידי הגברת VNTR לוקוס D1S80 מ- DNA תא אפיתל.

יישום של טביעת אצבע DNA באמצעות לוקוס D1S80 בשיעורי מעבדה

פרוטוקול זה הוא שיטה יעילה ומהירה של culturing שמרים ואת התבנית Aspergillus fumigatus מקבוצות גדולות של דגימות קרקע תוך 7 ימים בלבד. ניתן לשנות את השיטות בקלות כך שיתאימו למגוון של מדיות דגירה וטמפרטורות לפי הצורך לניסויים.

בידוד של שמרים ועובשים הניתנים לעיבוד מאדמות כדי לחקור את מבנה האוכלוסייה הפטרייתית

במחקר זה, יישום כתם נקודה תוכנן לזהות לפטוספירה משלושת הקלאדים העיקריים בדגימות מים. שיטה זו מאפשרת זיהוי של כמויות DNA מינימליות הממוקדות באופן ספציפי על ידי בדיקה המסומנת בדיגוקסיגנין, המזוהה בקלות על ידי נוגדן אנטי דיגוקסיגנין. גישה זו היא כלי רב ערך ומספק למטרות מיון.

תגובת שרשרת פולימראז והכלאה של כתם נקודה לזיהוי לפטוספירה בדגימות מים

למד ליצור טביעת אצבעות DNA של Mycobacterium leprae באמצעות VNTR ו-FLA מדגימים קליניים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר שרשראות זיהום הצרעת וזיהוי אנשים בסיכון.

טביעת אצבעות של DNA Mycobacterium leprae מתחים באמצעות מספר משתנה טנדם חזור (VNTR) - אורך ניתוח שבר (FLA)

גלה סרטונים נוספים