שיטת צינור רולר שונה לתרבית ארוכת טווח של פרוסות מוח מכרסמים

קח פרוסות מוח המתקבלות ממוח מכרסם. הפרוסות מורכבות מההיפוקמפוס, שמכיל נוירונים בהיפוקמפוס.

העבירו את פרוסות המוח לכיסויים המכילים פלזמת עוף.

מרחו פלזמה מעורבבת עם טרומבין על הפרוסות. תרומבין גורם לקרישת פלזמה, ויוצר פיגום ביולוגי המקדם הידבקות של הפרוסות לכיסויים.

קח צינורות גלילה שטוחים עם חור בצד השטוח ודיסק דבק המחובר סביב החור בחלק החיצוני של הצינורות.

מקם את הכיסויים על דיסקיות ההדבקה, וודא שפרוסות המוח פונות לחלק הפנימי של הצינורות.

הוסף מדיום תרבית עצבי לצינורות וזרום בתערובת פחמן דו חמצני ואוויר.

מכסים את הצינורות, מכניסים אותם למתלה רולר ודוגרים אותם בתנועת גלגול.

אוורור המסופק על ידי הדגירה המתגלגלת והחומרים המזינים של המדיום תומכים בתרבות ארוכת טווח של פרוסות המוח.

כדי להתחיל, הכן את מתלה צינור הגלילה, ועשה ג'יג כדי לסייע בקידוח חור בצינורות הגלילה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. בעזרת הג'יג, החזק במקומו צינור תרבית פלסטיק שטוח בגודל 1 סנטימטר כך שהצד השטוח פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, קדחו חור בקוטר 6 מילימטר כשהמרכז 1 סנטימטר מלמטה וממורכז בין דפנות הצינור.

בעזרת כלי הסרת הבור המסתובב, החלק את שולי החור וצור ארבעה חריצים בקצה הפנימי של החור כדי להקל על ניקוז החור במהלך הסיבוב. לאחר מכן, שטפו את הצינורות עם 70% אתנול, ולאחר מכן יבשו אותם באוויר בארון בטיחות ביולוגי. עקר את הצינורות בדיסקיות גומי סיליקון דביקות בגודל 12 מילימטר למשך 40 דקות מתחת למנורת ה-UV.

לאחר 20 דקות, מקם מחדש את הצינורות והדיסקים כך שכל המשטחים החשופים יהיו מעוקרים. לאחר מכן, קלף את הגב הלבן מדיסק הדבק. יישר את החורים והצמד את גומי הסיליקון לחלק החיצוני של הצינור.

לאחר קבלת הפרוסות, הניחו 2 מיקרוליטר פלזמת עוף במרכז הצד החרוט בתמונה של כיסוי מוכן. מורחים מעט את הפלזמה כדי להשיג נקודה בקוטר 3 עד 4 מילימטרים. לאחר מכן, השתמש במרית סטרילית בעלת קצה צר כדי להרים פרוסת מוח מוכנה. השתמש במלקחיים סגורים כדי לשמור את הפרוסה על קצה המרית תוך הרמת הפרוסה. גע במרית לנקודת הפלזמה על הכיסוי, ובעזרת מלקחיים סגורים, דחף את הפרוסה אל הכיסוי.

הוסף שכבה דקה של פלזמת אפרוח על הכיסוי לפני הנחת הפרוסה וכמות מינימלית של פלזמה שטופלה בטרומבין כדי לכסות את הפרוסה. אם הפרוסה צפה, היא לא תישאר דבוקה בעת הסרת הקריש.

לאחר מכן, מערבבים 2.5 מיקרוליטר פלזמה ו -2.5 מיקרוליטר תרומבין בצינור נפרד. מניחים במהירות 2.5 מיקרוליטר מהתערובת הזו מעל ומסביב לפרוסה, ופיפטה למעלה ולמטה בעדינות כדי לערבב אותה. הסר את כיסוי הפלסטיק השקוף מהצד החשוף של דבק גומי הסיליקון שהודבק בעבר לצינור הגליל. לאחר מכן, הנח את הכיסוי עם פרוסת המוח על הדבק, ויישר את הפרוסה בתוך החור.

כדי להבטיח הידבקות, הפעל לחץ אחיד ורך על הכיסוי עם האגודל על ידי לחיצה על הכיסוי כלפי מטה באופן שווה והחזקתו למשך כדקה אחת תוך העברתו לארון הבטיחות הביולוגי.

הלחץ על הכיסוי כדי להדביק אותו לצינור מבלי לדלוף חייב להיות נכון ומתוחזק מספיק זמן כדי לחסל תעלות אוויר באיטום. לחץ רב מדי יסדק את הכיסוי.

בארון בטיחות ביולוגי, הוסף 0.8 מיליליטר של מדיום תרבית A נוירו-בסיסי שלם לכל צינור. לאחר מכן, הזרימו תערובת של 5% פחמן דו חמצני, 95% אוויר דרך פיפטת מרעה סטרילית סתומה בכותנה המוחזקת היטב על ידי מהדק. השתמש בזה כדי לשטוף את צינור הגליל בתערובת הגז ולכסות במהירות את הצינור כשהוא נסוג מסביב לפיפטה.

לאחר מכן, סמן את הצינורות עם מספר הפרוסה ומספר המתלה. הכנס את הצינורות למתלה גלילה, וודא שהם מאוזנים מבחינה גיאומטרית. אם יש מספר אי זוגי של צינורות, הוסף צינורות ריקים לאיזון.

הנח את המדפים בחממת רולר של 35 מעלות צלזיוס עם גלילים מסובבים את מתלה הגלילה כדי לשמור על המדיום בתחתית הצינורות. הטה את החממה לאחור כ-5 מעלות על ידי הרמת החלק הקדמי שלה על לוח.