ייזום הרחבה והיווצרות מהירה של תאי עצב קשרים עצביים פונקציונליים

התחל בהרכבת מכשיר מיקרופלואידית המכיל מיקרו-תעלות בתוך צלחת מצופה ליזין.

זרע נוירונים עובריים עם מצע גידול לתוך הבארות המיקרופלואידיות, מה שמאפשר להם לזרום דרך המיקרו-ערוצים.

דגירה כדי להקל על התקשרות וצמיחה עצבית, ויצירת אוכלוסיות עצביות מבודדות פיזית.

פרק את ההתקנה והנח את המנה בתא מיקרומניפולטור עם זרימת מלח כדי לשמור על כדאיות התא.

הציגו חרוזים מצופים ליזין ליד הנוירונים, המאפשרים לנויריטים או להקרנות התאים להתחבר וליצור קומפלקסים של חרוזים-נויריטים.

בעזרת מיקרומניפולטור, הפעל יניקה כדי להפעיל קומפלקס חרוזים-נויריט מערוץ אחד.

משוך את הקומפלקס הזה כדי לגרום למתח מכני, מה שמוביל להרחבה מהירה של נויריט.

כוון אותו לעבר קומפלקס חרוזים-נוירון אחר והחזק אותו עם מיקרומניפולטור שני.

שמור את שני החרוזים במקומם כדי להקל על היווצרות קשר עצבי.

שחרר את היניקה והחלף את מי המלח במדיום תרבית.

דגירה כדי ליצור קשרים פונקציונליים בין נוירונים, לקדם תקשורת באמצעות נוירוטרנסמיטורים.

הסר את המדיום מהבארות העליונות של המכשירים המיקרופלואידיים מבלי לרוקן את הבארות. לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר מתמיסת התא המרוכז לבאר הימנית העליונה של המכשיר המיקרופלואידי, ובדוק במיקרוסקופ כיצד תאים זורמים בתוך המכשיר המיקרופלואידי.

כדי לצלחת תאים במכשיר האוכלוסיות המרובות, הוסף 20 מיקרוליטר מתמיסת התא המרוכז לכל אחת מהבארות העליונות. תחת המיקרוסקופ, בדוק אם התאים נמצאים בתוך התאים. לאחר מכן, הנח את המכשירים בחממה למשך 15 עד 30 דקות כדי לקדם את הצמדת התאים למצע.

לאחר שהתאים מתחברים למצע, הוסף 40 מיקרוליטר של NBM לשתי הבארות העליונות של מכשיר האוכלוסייה היחידה. זה יעזור להסיר את בועות האוויר מהמיקרו-ערוצים. הוסף 20 מיקרוליטר של NBM לבארות העליונות של מכשיר ריבוי האוכלוסיות, אותן בארות שבהן הוזרקו התאים. המדיה צריכה לבלוט מעט כדי ליצור מניסקוס חיובי, ולתת לבארות היבט של מאפינס.

יום עד יומיים לפני הסרת המכשירים המיקרופלואידיים, הוסף 2 מיליליטר של NBM מחומם מראש לכל צלחת דגימה, והציף את התאים. לאחר מכן, שמור את המכשירים בחממה. לאחר מכן, השתמש בפינצטה סטרילית ובקצה פיפטה כדי להסיר את המכשירים המיקרופלואידיים מהכיסויים, ולהשאיר תצורה מעוצבת של נוירונים.

בהליך זה, הוסף 40 עד 60 מיקרוליטר מהחרוזים המוכנים המצופים PDL לתרבית התאים. לאחר מכן, החזר את הדגימה לחממה למשך שעה כדי לקדם היווצרות מגעים סינפטיים. לאחר מכן, התקן את הדגימה במערך ניסיוני כך שניתן יהיה להעריך את התאים מלמעלה על ידי שני מיקרו-פיפטות וגם לגשת אליהם בצורה אופטית. בתצורה זו, מצלמת CCD ממוקמת ביציאה הצדדית של המיקרוסקופ לצילום תמונה. חבר כל פיפטה מלאה במי מלח למזרק של 1 מיליליטר. לאחר מכן, יש להחדיר את הדגימה בתמיסת מלח פיזיולוגית.

לאחר מכן, תחת המיקרוסקופ, בדוק את הפער בין שתי אוכלוסיות הנוירונים המבודדות כדי לוודא ששתי האוכלוסיות אינן מחוברות באופן טבעי. בחר חרוז PDL שאינו מחובר לנוירון בשדה הראייה. יישר את החרוז עם קצה מיקרופיפטה על ידי התמקדות בחרוז ולאחר מכן במיקרופיפטה.

לאחר מכן, הורידו את הקצה קרוב ככל האפשר לחרוז על ידי ניטור שלו דרך המיקרוסקופ. לאחר מכן, הפעילו לחץ שלילי על הפיפטה כדי להרים את החרוז, ושמרו על הלחץ השלילי לאורך כל הניסוי.

כעת, בחר חרוז PDL המחובר לנוירון בשדה הראייה, והצמד אותו למיקרופיפטה השנייה באמצעות יניקה. משוך את קומפלקס חרוז ה-PDL על ידי הזזה איטית של המיקרומניפולטור או שלב הדגימה ב-0.5 מיקרומטר לדקה למשך מיקרומטר אחד, והשהה למשך חמש דקות כדי לאפשר התחלת נויריט.

משוך את קומפלקס חרוז העצב PDL על ידי הזזתו לאט לרוחב במהירות של 0.5 מיקרומטר לדקה על פני 2 מיקרומטר. לאחר מכן, עצור לחמש דקות כדי לאפשר התארכות נויריט. לאחר התחלה מוצלחת והארכת נויריט עבור 5 המיקרומטרים הראשונים, משכו ברציפות את הנויריט במהירות של 20 מיקרומטר לדקה.

כדי לחבר את הנוירונים, בחרו אזור עשיר בנוירונים. השתמש בחרוזים אחרים כדי לאמוד את גובה קצה הפיפטה מעל הכיסוי, והורד את קומפלקס חרוז ה-PDL כך שהוא יוצר קשר פיזי עם הנויריטים. השאירו את קומפלקס חרוז ה-PDL במגע עם נויריט המטרה תוך מניפולציה של המיקרו-פיפטה השנייה. לאחר מכן, הורידו את הפיפטה השנייה עם חרוז ה-PDL השני על גבי הנויריט החדש שנוצר כ-20 מיקרומטר מהחרוז הראשון, והשתמשו בחרוז ה-PDL השני כדי לדחוף את חוט הנויריט החדש לעבר תא המטרה.

לאחר מכן, החזיקו את שני החרוזים במקומם למשך שעה לפחות. ודא את היעדר נפיחות מוקדית, עיבוי של הנויריטים המגעים עם החרוז באמצעות המיקרוסקופ. במהלך תקופה זו, שנה לאט את המדיום של הדגימה מתמיסת מלח פיזיולוגית ל-NBM מאוזן פחמן דו חמצני מחומם מראש.

שחרר את החרוז מהפיפטה השנייה על ידי שחרור היניקה. אם הנויריט החדש נשאר מחובר, שחררו גם את המהירות הראשונה. לאחר מכן, הנח בזהירות את הדגימה בחזרה באינקובטור כדי לחזק את הקשר העצבי לניסויים עתידיים.