יצירה ותחזוקה של תרביות פרוסות מרקמת גליובלסטומה אנושית

קחו למשל רקמת גליובלסטומה אנושית, גידול מוח ראשוני שמקורו בתאי גליה.

שטפו את הטישו באמצעות מדיום עיבוד קר כקרח כדי להסיר שאריות דם.

חותכים את הרקמה לחתיכות ומכניסים אותה לתבנית הטבעה המכילה אגרוז מותך.

מצננים את התבנית, ומאפשרים לאגרוז להתפלמר וליצור מטריצת ג'ל יציבה.

הסר את גוש הרקמה מהתבנית וקבע אותו על צלחת הדגימה של ויברטום.

הוסף את אמצעי העיבוד הקר כקרח כדי להטביע את הבלוק. העבירו תערובת גז מחומצן כדי לאוורר את המדיום, תוך שמירה על כדאיות הרקמות.

חתכו את רקמת הגידול המוטמעת לפרוסות דקות.

העבירו פרוסה לצלחת פטרי המכילה את מדיום העיבוד הקר כקרח כדי לשמר את ארכיטקטורת הרקמות.

לאחר מכן, צלחו את פרוסת הרקמה על תוספת קרום חדירה בבאר המכילה מדיום תחזוקת תרבית פרוסות.

שמור על הפרוסה בתנאים פיזיולוגיים. תרבית הפרוסות מוכנה לבדיקות במורד הזרם.

התחל בשימוש במלקחיים סטריליים כדי להניח תוספות תרבית PTFE ריקות לכל באר של צלחת בת שש בארות המכילה 1 מיליליטר של מדיום תחזוקת תרבית פרוסות לכל באר. לאחר הוספת כל התוספות, הנח את הצלחת באינקובטור תרבית רקמות לח במעטפת מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂.

לאחר מכן, הניחו את חתיכות רקמת הגידול בצלחת פטרי המכילה מדיום עיבוד קר כקרח, והשתמשו בפיפטה כדי לשטוף בעדינות את הרקמה שלוש פעמים עם מדיום טרי כדי להסיר את כל תאי הדם האדומים שנדבקו. לאחר השטיפה השלישית, השתמש באזמל כדי לחתוך את חתיכות הגידול לרצועות בגודל של כ-3 על 3 על 10 מילימטר, הסר בזהירות את כל הכלים המחוברים והימנע מרקמה נמקית או צרובה.

לאחר שכל הרקמה נחתכה, הוסיפו 5 עד 7 מיליליטר של אגרוז נוזלי של 37 מעלות צלזיוס לתבנית הטמעה מפלסטיק בגודל 2 סנטימטרים, וצננו את האגרוז על מצע קרח למשך דקה אחת. מניחים 2 עד 4 רצועות רקמה לתוך האגרוז, כשהציר הארוך מכוון אנכית, ומשאירים את הרקמות על קרח למשך 2 עד 5 דקות נוספות לאחר מיקומן.

כאשר האגרוז התמצק, חותכים את דפנות התבנית בעזרת אזמל כדי להסיר בעדינות את האגרוז מהתבנית, והשתמשו בטיפה נדיבה של דבק ציאנואקרילט כדי לקבע את גוש האגרוז לצלחת דגימת ויברטום.

כאשר הדבק התייצב, טבלו את גוש האגרוז במדיום עיבוד קר כקרח והשתמשו בפיפטה מפלסטיק גזוז וסטרילי כדי לבעבע תערובת של 5% CO₂ 95% O₂ לתוך המדיום בתוך מאגר הוויברטום. הגדר את עובי פרוסת הוויברטום ל-300 עד 350 מיקרון, והתאם את המהירות המתקדמת של הלהב ואת משרעת הלהב בהתאם לעקביות הרקמה ולמפרט הרטט.

השג את המספר המתאים של פרוסות על פי הניתוח הניסיוני המתוכנן. שימוש במיקרו-מרית מנירוסטה כדי להעביר את הפרוסות לצלחת פטרי המכילה מדיום עיבוד קר כקרח בזמן שהן נרכשות. לאחר שכל הפרוסות נרכשו, השתמש במיקרו-מרית כדי להעביר כל פרוסה לתוספת PTFE אחת.

לאחר דגירה של 12 עד 24 שעות, יש לאזן צלחת חדשה בת שש בארות המכילה מדיום תחזוקת תרבית פרוסות טרי בחממת תרבית התאים למשך 15 דקות. לאחר מכן השתמש במלקחיים סטריליים כדי לתפוס כל תוספת בשפה, והעביר את התוספות לבארות בודדות של צלחת שש הבארות החדשה.