הידרוג'ל על בסיס חומצה היאלורונית לתרבית תלת מימדית של תאי גליובלסטומה

התחל עם גליומספרות, אגרגטים של תאים שמקורם בגידול מוח או גליובלסטומה.

הוסף אנזימי דיסוציאציה. דגירה כדי להפריד את תאי הגליובלסטומה ולקבל תרחיף חד-תאי.

לאחר מכן, הכניסו מדיום תרבית מועשר בסרום כדי לעצור את פעילות האנזים.

צנטריפוגה והסר את הסופרנטנט, ואז השהה מחדש את התאים.

מסננים את המתלה, ואז צנטריפוגה ומסירים את הסופרנטנט.

השעו מחדש את התאים במבשרי הידרוג'ל המכילים פפטידים קטנים.

העמיסו את התערובת הזו לבארות עם תבנית סיליקון שהורכבה מראש המכילה חומצה היאלורונית.

מערבבים את התמיסה. דגירה כדי לאפשר את האינטראקציה בין החומצה ההיאלורונית לקודמני ההידרוג'ל, ויוצרים הידרוג'ל המקל על לכידת התאים.

שכבו את ההידרוג'ל במצע תרבית כדי לשמור על הישרדות התאים.

לאחר פירוק התבנית, דגרו את ההידרוג'ל.

בתוך ההידרוג'ל, חלבוני ההדבקה על התאים מקיימים אינטראקציה עם פפטידים קודמים וחומצה היאלורונית.

זה גורם לתאים ליצור אשכולות קטנים ולפתח תרבית תלת מימדית.

כדי להתחיל, הניחו תבניות גומי סיליקון נקיות ויבשות בכל באר של צלחת 12 בארות שאינה מטופלת בתרבית רקמות, והשתמשו בקצה הנקי והקהה של קצה פיפטה כדי להדביק את התבניות לתחתית הצלחת. לאחר בדיקת האיטום בין התבניות לתחתית הבאר, אסוף את כדורי הגליומה המנותקים מתרבית תאי גליובלסטומה על ידי צנטריפוגה, והשהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של אנזים דיסוציאציה של תאים.

לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, יש לערבב את הצינור בהקשה עדינה ולעצור את התגובה האנזימטית עם ארבעה מיליליטר של מדיום שלם. צנטריפוגה שוב של התאים והשעיית הגלולה במיליליטר אחד של מדיום שלם טרי לפני מאמצים את התאים דרך מסנן של 70 מיקרומטר. שטפו את המסננת בארבעה מיליליטר נוספים של מדיום שלם ופצלו את המתלה לשני חלקים של 8 x 10⁴ תאים לכל צינור צנטריפוגה.

אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, והשהה כדור אחד ב-80 מיקרוליטר של פוליאתילן גליקול מלימיד טרי, או PEG-Mal-RGD, וכדור אחד ב-80 מיקרוליטר של תמיסת PEG-Mal-CYS שהוכנה טרייה לכל תבנית. בעזרת קצה מיקרופיפטה רחב פתח בנפח 200 מיקרוליטר, הוסף 40 מיקרוליטר של תמיסת חומצה היאלורונית לכל תבנית סיליקון גומי, ואחריה 40 מיקרוליטר של תמיסת התאים PEG-Mal-CYS או PEG-Mal-RGD, תוך פיפטינג מהיר למעלה ולמטה לא יותר מ-10 פעמים לכל תבנית לערבוב.

בגלל זמן הג'לציה המהיר, לאחר ערבוב שני רכיבי ההידרוג'ל, חשוב להשתמש בקצה פיפטה רחב פתח כדי לערבב את התמיסות יחד במהירות אך ביסודיות. שלב זה דורש תרגול.

לאחר מכן, הנח את התאים העטופים בג'ל לתוך אינקובטור תרבית תאים של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 5 עד 10 דקות. בתום הדגירה מוסיפים 2 עד 2.5 מיליליטר מדיום תרבית לכל ג'ל והשתמשו בקצה פיפטה סטרילי של שני מיקרוליטר ומלקחיים כדי להפריד בעדינות את הג'לים מדפנות התבניות. לאחר מכן, השתמש במלקחיים מעוקרים כדי להסיר את התבניות מבארות הצלחת ולהחזיר את הצלחת לחממת התאים.