JoVE Encyclopedia of Experiments
מדעי המוח
0 צפיות • 5:12 דק' • July 8th, 2025
התחל עם מוח של גור עכברים.
בודד את המוח הקטן וקבל פרוסות רקמה בעובי מתאים.
מעבירים את הפרוסות על תוספות ממברנה המונחות בתוך בארות צלחת תרבות המכילות מדיה.
בבארות מטופלות, המדיה מכילה תרכובת בדיקה נוירו-פרוטקטיבית. בארות בקרה חסרות את המתחם. דגירה.
בתנאי בקרה, תאי פורקינג'ה המוח הקטן עוברים אפופטוזיס, המחקה התפתחות מוקדמת לאחר הלידה in vivo.
בבארות מטופלות, בהתאם לפוטנציאל שלה, התרכובת עשויה להגן על התאים מפני אפופטוזיס.
שוטפים את הפרוסות ומתקנים אותן כדי לשמור על שלמות התאים.
העבירו את הפרוסות לתמיסה חוסמת חדירות כדי לחלחל את קרומי התאים ולחסום אתרי קשירה לא ספציפיים.
שכבת נוגדנים ראשוניים המכוונים לחלבון קושר סידן המתבטא במיוחד בתאי פורקינג'ה.
שטפו והכניסו נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור המכוונים לנוגדנים הראשוניים.
צבעו את הגרעינים בצבע קושר DNA והרכיבו את הפרוסות.
באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, כמת את תאי פורקינג'ה ברי קיימא כדי לזהות את הפוטנציאל הנוירו-פרוטקטיבי של תרכובת הבדיקה
כדי לקצור את המוח הקטן, השתמש במלקחיים ישרים כדי לתפוס את ראש הגור באף, והשתמש במספריים לעיניים ישרות כדי לחתוך את הקרקפת מהקצה האחורי לרוחב לקו האמצע. חתכו את הגולגולת באותו אופן, כוונו את קצות המספריים החוצה כדי למנוע נזק למוח הקטן, והשתמשו במרית כדי להעביר את המוח לצלחת של 60 מילימטר המכילה HBSS קר ו-5 מיליגרם למיליליטר גלוקוז.
השתמש במלקחיים החבישה הישרים כדי לנתח בזהירות את המוח הקטן, והשתמש במלקחיים עדינים ומעוקלים סטריליים כדי להניח את הרקמה על דיסק פלסטיק על שולחן החיתוך של קוצץ טישו. סובב את שולחן החיתוך כדי לכוון את הרקמה כדי לאפשר רכישת חלקים פרסגיטליים, ומשוך את כפתור שחרור השולחן ימינה כדי להזיז את שולחן החיתוך עד שהלהב ממוקם בקצה הרקמה. לאחר מכן, כוונן את עובי הפרוסה ל-350 מיקרומטר ואת מהירות הלהב לבינונית והפעל את המסוק. כאשר כל המוח הקטן נחתך, כבה את המסוק.
בעזרת מלקחיים סטריליים, החזק את הדיסק מעל צלחת חדשה של 60 מילימטר. השתמש בפיפטת העברה כדי לשטוף HBSS בתוספת גלוקוז על הדיסק כך שהפרוסות ייפלו לתוך הצלחת. לאחר מכן, נגיעה בדגימות בצורה מינימלית ככל האפשר, השתמש במיקרו-בדיקה כדי להפריד את הפרוסות.
השתמש בפיפטת ההעברה כדי לבחור את חלקי המוח הקטן הקרובים לוורמיס על תוספות תרבית תאים בודדות בצלחת שש הבארות, והשתמש במיקרו-בדיקה כדי למקם את הפרוסות במרכז כל תוספת. לאחר שכל הפרוסות הונחו, שאפו בזהירות את עודפי ה-HBSS בתוספת גלוקוז והחזירו את הצלחת לחממת תרבית התאים.
לצביעה אימונופלואורסצנטית, הסר את הסופרנטנט מכל באר ושטוף את התוספות עם PBS. מקבעים את הפרוסות עם 1 מיליליטר פרפורמלדהיד קר של 4% בבאר של כל תוספת, ו -500 מיקרוליטר על גבי כל תוספת למשך שעה.
בתום הקיבוע יש לשטוף את התוספות ארבע פעמים למשך 10 דקות עם 1 מיליליטר PBS טרי מתחת לכל תוספת ו-500 מיקרוליטר PBS טרי על גבי כל תוספת לכל שטיפה על שייקר מסלולי. מלאו מראש כל באר של צלחת 24 בארות ב -500 מיקרוליטר PBS-TB, והשתמשו במכחול כדי להעביר את פרוסות המוח הקטן מכל הכנסת תרבית תאים לבארות בודדות של צלחת של 24 בארות.
מחלחלים וחוסמים את הפרוסות בטמפרטורת החדר למשך שעה. בתום הדגירה, סמנו את התאים עם 200 מיקרוליטר של הנוגדן העיקרי המעניין מדולל ב-PBS-TB לבאר למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס על שייקר המסלול.
למחרת בבוקר, שטפו את הפרוסות ארבע פעמים למשך 10 דקות ו-500 מיקרוליטר PBS טרי בכל שטיפה על השייקר לפני תיוג הדגימות עם הנוגדנים המשניים המתאימים עם פלואורופור למשך שעתיים בטמפרטורת החדר על השייקר המוגן מאור.
בתום הדגירה, הכתים את החלקים ב-500 מיקרוליטר של כתם גרעיני מתאים לבאר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר המוגן מפני אור, והשתמש בפיפטה העברה כדי להרכיב את הפרוסות על שקופיות זכוכית.
לאחר מכן, הניחו לחלקים להתייבש לחלוטין באוויר לפני התייבשות עם PBS והרכבה של הרקמות עם כיסויים המצופים בכ-80 מיקרוליטר של מדיום הרכבה. לאחר שמדיום ההרכבה נרפא, חלקי המוח הקטן מוכנים לצילום.