ניתוק וטיפוח תאי עצב מדגימות רקמת ההיפוקמפוס

התחל עם דגימות רקמת היפוקמפוס המכילות נוירונים ותאים שונים שאינם עצביים.

הוסף תמיסת אנזים פרוטאז. האנזים מפרק את המטריצה החוץ-תאית של הרקמה, ויוזם דיסוציאציה של תאים.

יש לשטוף עם מדיום ציפוי להסרת שאריות אנזימים.

פיפטה את הרקמה המעוכלת שוב ושוב כדי לנתק מכנית את התאים מהרקמה, וליצור תרחיף של תא בודד.

צנטריפוגה והסר את הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים במדיום הציפוי.

זרע את התאים על כיסוי מצופה פולי-D-ליזין בצלחת מרובת בארות. ליזין משפר את החיבור לתאים.

החלף את מדיום הציפוי במדיום תחזוקת נוירונים המכיל חומרים מזינים חיוניים להישרדות נוירונים.

רענן מחצית מהמדיה עם אמצעי תחזוקה המכיל ארבינוזילציטוזין, או Ara-C.

Ara-C נכנס לתאים ומעכב באופן סלקטיבי את צמיחתם של תאים שאינם עצביים, מה שמוביל למותם.

החלף את המדיה באמצעי תחזוקה טריים כדי לתמוך בהישרדות תאי העצב.

כדי לנתק את נוירוני ההיפוקמפוס לצורך תרבית, יש להפשיר את תמיסת האנזים פרוטאז, ולחמם מראש את מדיום הציפוי ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את ההיפוקמפוס המנותח עם SLDS. לאחר מכן הסר אותו, והוסף 2 מיליליטר תמיסת אנזים פרוטאז, ודגר את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לאחר מכן, שטפו את ההיפוקמפוס עם 5 עד 10 מיליליטר של מדיום ציפוי פעמיים, והוסיפו 5 מיליליטר של מדיום ציפוי. להפריד את ההיפוקמפוס לתאים בודדים על ידי יצירת מערבולת קטנה באמצעות פיפטה עם קצה פלסטיק של 1 מיליליטר. פיפטה למעלה ולמטה כ-40 פעמים, תוך הימנעות מהיווצרות בועות חמצן עד שהתמיסה הופכת לעכורה ולא נשארות חתיכות גדולות של אקספלנט.

לאחר מכן, צנטריפוגה של התאים בכוח הכבידה פי 1,125 למשך 3 דקות. הסר את הסופרנטנט כשהתאים שקועים במדיום, והשהה מחדש את התאים ב-145 מיליליטר של מדיום ציפוי. לאחר מכן, הוסף 1 מיליליטר של מתלה התאים לכל באר לצלחת של 24 בארות. דגרו את התאים במדיום הציפוי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד ארבע שעות.

לאחר מכן, הסר את אמצעי הציפוי והחלף אותו באמצעי תחזוקה טרי. לאחר יומיים, החלף מחצית מהמדיום בשני Ara-C מיקרו-מולאריים מומסים במדיום תחזוקה כדי לעכב צמיחה של פיברובלסטים, תאי אנדותל ותאי גליה. לאחר מכן, לאחר חשיפת התאים ל-Ara-C למשך יומיים, החלף את המדיום במדיום תחזוקה טרי.