טכניקה ליצירת מונושכבה דו-ממדית של תאי המוח הקטן מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים

התחל עם מושבות תאי גזע פלוריפוטנטיות המושרות על ידי בני אדם שגודלו על מטריצת קרום בסיס דביקה.

הוסף מדיום התמיינות מוחי המכיל הורמון ספציפי, גורם גדילה ומעכבי מולקולות קטנות.

הרם את המושבות באמצעות פיפטת זכוכית, והעביר אותן לצלחת חיבור נמוכה במיוחד.

משטח ההתקשרות הנמוך שומר על התאים בתרחיף, ומקל על הצטברותם לגופים עובריים תלת מימדיים, או EBs.

ההורמון, גורם הגדילה והמעכבים נקשרים לאתרי היעד שלהם, ומקדמים התמיינות של תאי גזע לאבות עצביים.

העבירו את ה-EBs לבארות צלחת תרבית המצופות בפולימר סינטטי וחלבון הדבקה כדי להקל על חיבור EB.

החלף את המדיום במדיום התמיינות נטול מעכבים.

התאים מתחילים לנדוד החוצה מה-EBs, ויוצרים שכבה חד-ממדית דו-ממדית.

הסר את המדיום והוסף מדיום התבגרות מוח.

גורמי גדילה במדיום גורמים להתבגרות של אבות עצביים לקודמנים עצביים מובחנים במוח.

ביום האפס, הוסף 1 מיליליטר של מדיום התמיינות מוחי בתוספת 10 מיקרו-מולרי Y27632 ו-SB431542 לכל באר של שש בארות חיבור נמוך במיוחד או צלחת ULA, והנח אותו באינקובטור עד שהמושבות המורמות מוכנות להוספה לבארות. נקה את התאים המובחנים באמצעות פיפטת זכוכית משוכה. שאפו את המדיום, והוסיפו 1 מיליליטר של תמיסת מעבר iPSC לכל צלחת של 35 מילימטר.

לאחר שלוש דקות של דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, יש לשאוב את המדיום ולהוסיף 2 מיליליטר של מדיום התמיינות מוחי בתוספת 10 מיקרומולר Y27632 ו-SB431542. בהגדלה פי 4 של מיקרוסקופ מועבר אור הפוך, הרם את המושבות באמצעות הקצה הכפוף של פיפטת הזכוכית המשוכה. לאחר הרמת כל מושבה, העבירו בעדינות את כל המושבות לבאר אחת של צלחת ULA בת 6 בארות באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר. חזרו על התהליך הזה עבור כל לוחית iPSC, ודגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני.

ביום השני, הוסף FGF2 לכל באר כדי להתאים ריכוז סופי של 50 ננוגרם למיליליטר. ביום השביעי, שנה שליש מהמדיום על ידי שאיבת 1 מיליליטר של מדיום משומש, והחלפתו במיליליטר אחד של מדיום התמיינות מוחי טרי. דגרו על הגופים העובריים למשך שבעה ימים.

ביום ה-14, סובבו את הצלחת כדי לאסוף את כל הגופים העובריים במרכז הצלחת. לאחר מכן, הטה את הצלחת ושאף את כל המדיום המושקע באמצעות פיפטור של 1000 מיקרוליטר מהקצה. ככל שהכמות הבינונית יורדת, הניחו לאט את הצלחת שטוחה והמשיכו לשאוף, והשאירו מספיק מדיום כדי למנוע ייבוש הגופים העובריים.

לאחר מכן, הוסף 3 מיליליטר של מדיום התמיינות מוחי טרי בתוספת 10 מיקרומולר. Y27632. לאחר מכן, העבירו את הגופים העובריים באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר לצלחת מצופה למינין פולי-L-אורניתין. ביום ה-15, שאפו את המדיום והחליפו אותו במדיום התמיינות מוחי טרי.