בידוד וטיפוח תאים מגליומה פונטינה פנימית מפוזרת

התחל עם שברי רקמת גזע מוח המכילים גליומה פונטינית פנימית מפוזרת, גידול שמקורו בתאי אב גליה בסביבה עשירה בעצבים מיאליניים.

לטפל באנזימים פרוטאוליטיים כדי לפרק את המטריצה החוץ-תאית של הרקמה.

לאחר הדגירה, יש לזרוק שוב ושוב את התוכן כדי להקל על דיסוציאציה של התאים ופירוק מעטפת המיאלין.

מסנן וצנטריפוגה לאיסוף התאים. הסר את הסופרנטנט והשהה אותם מחדש במאגר קר.

הוסף תמיסת סוכרוז להפרדת שיפוע צפיפות וערבב היטב.

לאחר מכן, צנטריפוגה כדי להפריד את התאים הכבדים יותר מפסולת המיאלין הקלה יותר.

הסר את שכבת המיאלין והוסף מאגר ליזה RBC.

הוסף חיץ קר כדי לעצור את פעולת הליזיס. צנטריפוגה והסר את הסופרנטנט כדי לחסל את ה-RBCs הליזים.

השעו מחדש את התאים במדיום נוירובזאלי חם ותרבו אותם בבקבוק לא מצופה.

היעדר גורמים נוירוטרופיים גורם למוות עצבי, בעוד שתאי אב הגליה מנצלים חומרים מזינים וגורמי גדילה, מה שמוביל לשגשוג. הוסף מדיום טרי כדי לשמור על רמות מקדם הגדילה.

עם הזמן, תאים אלה מצטברים באופן ספונטני לאשכולות תאים, ויוצרים נוירוספרות צפות חופשיות.

בהליך זה, צנטריפוגה את הצינור החרוטי המכיל את שברי הרקמה הנותרים למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט והוסף את תמיסת העיכול האנזימטית המחוממת מראש כך שיש 5 מיליליטר תמיסת עיכול לכל מיליליטר רקמה. לאחר מכן, אטמו את מכסה הצינור החרוטי בסרט מעבדה ודגרו את התגובה על מסובב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר הדגירה, יש לשלש את הדגימות בעדינות. בעזרת פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר, פיפטה את הדגימה למעלה ולמטה במשך 6 עד 8 פעמים והימנע מיצירת בועות אוויר מוגזמות. לאחר מכן, הוסף קצה פיפטה בנפח 1000 מיקרוליטר לקצה הפיפטה ושלש את הדגימה למשך 6 עד 8 פעמים נוספות.

אפשר לכל הנתחים שנותרו להתיישב בתחתית הצינור. לאחר מכן, הסר וסנן את הסופרנטנט כשהתא עדיין תלוי דרך מסנן של 100 מיקרון לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר שכותרתו דיסוציאציה אנזימטית, ואחסן אותו על קרח. לאחר מכן, צנטריפוגה את צינור הדיסוציאציה האנזימטי למשך חמש דקות והמשיכו לצנטריפוגה בשיפוע סוכרוז. אם הדגימה עדיין תלויה בתמיסה, צנטריפוגה אותה למשך חמש דקות.

לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הרקמה ב -20 מיליליטר HBSS קר ללא סידן ומגנזיום. לאחר מכן, העלו את הנפח ל -25 מיליליטר עם HBSS קר. לאט, הוסיפו 25 מיליליטר של תמיסת סוכרוז מולרית 1.8 והפכו את הצינור לערבוב. התוצאה היא שיפוע סוכרוז מולארי של 0.9

.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ללא הפסקה למשך 10 דקות. שאפו בזהירות את שאריות המיאלין וכמה שיותר תמיסת סוכרוז. לאחר מכן, שטפו את הדגימה על ידי הוספת 30 מיליליטר HBSS קר ללא סידן ומגנזיום, וערבוב עדין. לאחר מכן, צנטריפוגה למשך חמש דקות.

בהליך זה, הסר את חומר הכביסה. הוסף 5 מיליליטר של מאגר ליזה ACK והשהה בעדינות את גלולת התא, סובב את הצינור למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הרוו את הליזיס על ידי הוספת 30 מיליליטר HBSS קר ללא סידן ומגנזיום.

לאחר מכן, צנטריפוגה אותו למשך חמש דקות. השעו מחדש את גלולת התא הסופית ב-10 עד 15 מיליליטר של TSM שלם חם עם גורמי גדילה, וכימתו את צפיפות התאים הקיימא על המוציטומטר באמצעות אי הכללה כחולה של טריפאן. לאחר מכן, העבר את תרחיף התאים הסופי לבקבוק תרבית T75 חדש. הוסף גורמי גדילה נוספים כל יומיים כדי לשמור על רמות גורמי הגדילה הכוללות ולעקוב אחר התפתחות נוירוספרות של תאי גידול.