בידוד וטיפוח אבות נוירונים גרעיניים של המוח הקטן מורין

קחו למשל גור עכברים קטן.

הומוגניזציה שלהם לשברים קטנים יותר.

הוסיפו אנזים פרוטאוליטי כדי לעכל את המטריצה החוץ-תאית של הרקמה, לשחרר אבות גרגירים במוח הקטן, או CGNPs, ואסטרוציטים.

הוסף מצע תרבית CGNP המכיל סרום כדי לעצור את הפעילות האנזימטית. צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט העשיר באנזימים.

השהה מחדש את שברי הרקמה במדיית CGNP. לנתק את הרקמה באופן מכני כדי לשחרר את התאים.

ברגע שהפסולת שוקעת, העבירו את הסופרנטנט שמכיל את התאים לצינור חדש.

צנטריפוגה והסר את הסופרנטנט עם פסולת.

השעו מחדש את התאים במצע CGNP, וזרעו אותם על בארות צלחות מרובות בארות המצופות בפולי-D-ליזין. דגירה.

אסטרוציטים מתיישבים ונצמדים חזק לציפוי הפולי-D-ליזין, בהשוואה ל-CGNPs.

נער את הצלחת ואסוף את הסופרנטנט המכיל CGNPs. צנטריפוגה והסר את הסופרנטנט.

השעו מחדש CGNPs במדיית CGNP וזרעו אותם על צלחת מרובת בארות מצופה פולי-L-ornithine. דגירה.

CGNPs נצמדים למשטח המצופה ומתרבים, בסיוע רכיבי המדיה ופולי-L-אורניתין.

העבירו שלושה עד חמישה צרבלה לצינורות של 15 מיליליטר. שטפו את המוח הקטן עם גלוקוז HBSS לפני הצנטריפוגה. צנטריפוגה את הצינורות כדי לאסוף את הרקמה. לאחר הכביסה הסופית, הומוגניזציה של המוח הקטן על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה פעמיים-שלוש עם פיפטה של 1 מיליליטר עד שהשברים בגודל של 0.5 עד 1 מילימטר קוביות.

הסר בעדינות את כל הנוזלים עד שנותרים 2.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 0.05% טריפסין לתוך הצינור עם גלוקוז HBSS המכיל את המוח הקטן, ודגר את הרקמה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. הפוך את הרקמה כל 1 עד 3 דקות. לאחר הדגירה יש לעצור את העיכול על ידי הוספת 5 מיליליטר של מדיום תרבית תאים cGMP או CGM, ולאסוף את הרקמה על ידי צנטריפוגה כמו קודם.

לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והוסף 1 מיליליטר CGM. יש לשלש את הרקמה עם קצה הפיפטה של 1 מיליליטר, ולהימנע מהיווצרות בועות אוויר. לאחר מכן, הוסיפו 5 מיליליטר של CGM, ודגרו את התערובת במשך שתי דקות על קרח כדי ליישב שאריות רקמות. לאחר שהרקמה התייצבה, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 15 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 2 מיליליטר של CGM לשאריות הרקמה, וחזור על הליך הטריטורציה לפני קצירת הסופרנטנט והשלכת שאריות הרקמה.

אסוף את הסופרנטנטים מכל צינור של 15 מיליליטר של רקמה, וצנטריפוגה כדי לאסוף את תאי המוח הקטן. השעו מחדש את הגלולה ב -10 מיליליטר CGM. מאחר שאסטרוציטים נצמדים מהר יותר וחזק יותר לפולי-D-ליזין מאשר ל-cGMPs, הוסיפו עד 4 מיליליטר של תרחיף תאים לבארות של לוחות 6 בארות מצופים פולי-D-ליזין, ודגרו במשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס כדי להסיר אסטרוציטים.

לנער את הצלחת. אספו את הסופרנטנט בצינור של 15 מיליליטר, ואז צנטריפוגה את הסופרנטנט כמו קודם. השעו מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של CGM, וספרו את התאים עם תא ספירה של נויבאואר. לאחר 4 עד 6 שעות, ה-cGMP המודבקים נראים עגולים ומתרבים. זרעו את התאים ב-CGM על צלחות מצופות פולי-L-אורניתין, ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ו-100% לחות יחסית.