יצירת ספרואידים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

התחל עם מושבות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים או hPSCs המחוברים למצע מתאים במדיום תרבית.

הסר את המדיום. הוסף מדיום עצבי המכיל מעכבים ספציפיים ודגירה.

מעכבים אלה מכוונים את ההתבגרות של hPSCs לעבר שושלת עצבית, ויוצרים מושבות נוירו-אקטודרמליות. אלה הם קודמים למבנים כדוריים קטנים שנקראים ספרואידים.

הסר את המדיום ושטוף עם מאגר מלח.

דגירה עם אנזים עיכול כדי לנתק את המושבות מהצלחת.

הוסף את המדיום העצבי כדי לעצור את הפעילות האנזימטית.

אוספים את המושבות ומעבירים אותן לצינור.

הניחו להם להתיישב, ואז השליכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את המושבות במדיום עצבי המכיל גורם גדילה.

מעבירים את המושבות לצלחת מרובת בארות ודוגרים.

גורם גדילה זה מקל על ארגון עצמי והכפלה של תאים נוירואקטודרמליים, מה שמוביל אותם ליצירת ספרואיד.

כדי להתחיל, צלח את מושבות ה-hPSC על מטריצת ממברנת בסיס מוסמכת hESC מבאר אחת של צלחת של 6 בארות במפגש של 60% לשלוש בארות כדי להשיג צפיפות של 20% עד 30%, ולאחר מכן, המשך באינדוקציה של מושבות נוירואקטודרמליות דו-ממדיות.

הוסף מדיה N2 טרייה בתוספת מעכבי SMAD כפולים מדי יום לכל באר במשך 3 הימים הבאים. ליצירת ספרואידים נוירואקטודרמליים תלת מימדיים ממושבות נוירואקטודרמליות דו-ממדיות, הסר 2 מיליליטר של מדיום N2 מצלחת 6 הבארות, ושטוף פעם אחת עם HBSS כדי להבטיח שכל מדיום ה-N2 יוסר.

הוסף 1 מיליליטר של דיספאז לכל באר המכילה מושבה. דגרו את הצלחת למשך 20 עד 25 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס, ובדקו אם יש ניתוק מושבה באופן קבוע. בתום הדגירה, כדי להפסיק את פעילות האנזים דיספאז, הוסף 1 מיליליטר של מדיום N2 לבאר. בעזרת קצה פיפטה P1000 רחב קדח או קצה פיפטה P1000 שונה עם מספריים סטריליים, העבירו את המושבות לצינור של 15 מיליליטר, ואפשרו לגושי המושבה לשקוע לתחתית הצינור עם כוח הכבידה.

לאחר מכן, עם קצה פיפטה P1000 סטנדרטי, הסר בזהירות את הסופרנטנט. החלף אותו ב-1 מיליליטר של מדיום N2 טרי, וחזור על הכביסה שלוש פעמים כדי להבטיח הסרה מוחלטת של התפוצה. לאחר השעיית גושי התאים ומדיום N2, העבירו את תרחיף התא לבאר אחת של צלחת של 6 בארות, והוסיפו 40 ננוגרם למיליליטר של bFGF.