בידוד תאי גזע מהמוח הקטן של העכבר לאחר הלידה והתמיינות לתאים עצביים

קחו תאים שבודדו ממוח קטן של עכבר שזה עתה נולד המכילים תאי גזע, נוירונים וגליה.

הוסף מיקרו-חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים הנקשרים לגליקופרוטאין משטח ספציפי לתאי גזע.

צנטריפוגה, הסר את החרוזים הלא קשורים והשהה מחדש את התאים במאגר.

טען את התאים על עמוד הפרדה הממוקם במפריד מגנטי, השומר על תאי הגזע הקשורים למיקרו-חרוזים בזמן שתאים אחרים זורמים דרכו.

הוסף מדיום נוירוספירה כדי לחסל את התאים ולהעביר אותם למיקרו-צלחת. דגירה כדי לגרום להיווצרות נוירוספרות ראשוניות, מושבות המתחדשות מעצמן של תאי גזע.

צנטריפוגה והשליכו את המדיום. השעו מחדש את הנוירוספרות במדיום המכיל אנזימים כדי לעכל את חלבוני ההדבקה התאית.

צנטריפוגה והסר את האנזימים. הוסף את המדיום הנוירוספירה ונתק מכנית את התאים.

דגירה כדי לאפשר התפשטות תאי גזע ויצירת נוירוספירה משנית, בעוד שהתאים הממוינים חסרי מאפייני תאי גזע אינם מתרבים.

העבירו את הנוירוספרות למדיום התמיינות ודגירה, תוך קידום התמיינות לנוירונים וגליה.

הניחו את צינורות הצנטריפוגה על קרח, ואז סננו את התאים המנותקים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מיליליטר. מעל המסנן 10 מיליליטר תמיסת HBSS קרה כקרח, כדי להבטיח שהתאים יעברו דרך הרשת.

העבירו את התאים המסוננים לצינור צנטריפוגה טרי של 15 מיליליטר, וצנטריפוגה את המתלה ב -300 פעמים גרם למשך 10 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השתמש בשואב ואקום כדי להסיר את הסופרנטנט לחלוטין.

השעו מחדש את כדור התא ב-160 מיקרוליטר של מאגר עמוד מגנטי קר כקרח. הוסף 40 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים אנטי-פרומינין-1 לתרחיף התא. לאחר מכן, דגרו את הצינורות במקרר למשך 15 דקות, כדי לאפשר לנוגדנים להיקשר לתאים המבטאים פרומינין-1.

שוטפים את התאים עם 1 עד 2 מיליליטר של מאגר עמודים X, וצנטריפוגה אותם ב -300 פעמים גרם למשך 10 דקות. שאפו את הסופרנטנט והשהו מחדש את הכדור ב-1 מיליליטר של מאגר עמוד X. הניחו את העמודים המגנטיים על המעמד המגנטי, ושטפו אותם פעם אחת עם 500 מיקרוליטר של מאגר X. מרחו את תרחיף התא המסומן על העמוד, ואספו את הזרימה בצינורות טריים של 15 מיליליטר.

שטפו את העמוד שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר מאגר X. לאחר מכן, הסר את העמודים מהשדה המגנטי והנח אותם בצינורות של 1.5 מיליליטר. הוסף 1 מיליליטר של מדיום תרבית, ודחף את הבוכנה לתוך העמודה כדי לשטוף החוצה את התאים המתויגים בחרוזי פרומינין-1.

כדי לעבור את הנוירוספרות, העבירו אותן יחד עם מדיום התרבות לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר. גלולה את הנוירוספרות על ידי צנטריפוגה ב -300 פעמים גרם למשך 5 דקות, והשליכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את הגלולה ב-5 מיליליטר של חומר דיסוציאציה עם תמיסת פפאין או טריפסין 0.05%, ודגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צנטריפוגה שוב את מתלה התאים. לאחר מכן, השעו מחדש את התאים ב-5 מיליליטר של מדיום נוירוספרי, ונתקו אותם על ידי פיפטה איטית למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטת מרעה. צלחת התאים במדיה נוירוספרית כמתואר בפרוטוקול הטקסט, והעשיר אותם בנוירוספירות משניות לאחר 7 עד 10 ימים בתרבית כפי שתואר קודם לכן.