טכניקה לבידוד תאי לוויין מרקמת שריר ראש חולדה

התחל עם שריר ראש חולדה וקוצץ אותו לשברים.

הוסיפו קוקטייל של אנזימים מפרקי חלבון ודגרו בניעור עדין.

האנזימים מעכלים את המטריצה החוץ-תאית של הרקמה, ומשחררים את סיבי השריר.

הוסף מדיה המכילה חלבוני סרום כדי לנטרל את האנזימים.

העבירו את הרקמה לצינור, צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את הרקמה במדיה. חזור על שיבוש מכני וצנטריפוגה פעמיים כדי להשיג תרחיף הומוגני של תאי לוויין - תאי גזע החיוניים לתיקון והתחדשות שרירים.

אספו את הסופרנטנט המכיל תא לווין.

עוברים דרך מסננת תאים כדי לקבל מתלה חד-תאיים. צנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים במדיה.

הנח טיפות של תרחיף התאים על בארות שקופיות תא מצופות חלבון מטריצה חוץ-תאית.

המשטח המצופה מקל על חיבור תאי לוויין. הוסף מדיה לבארות.

גורמי גדילה במדיה גורמים לשגשוג והתמיינות של תאי לוויין למיובלסטים - מבשרי תאי שריר, אשר מתרבים עוד יותר ומתמזגים ליצירת צינורות שריר מרובי גרעינים.

השרירים מבשילים בסופו של דבר לסיבי שריר.

כדי לבודד את תאי הלוויין, העבירו כל שריר לבארות בודדות של צלחת של שש בארות, וחתכו את הרקמות לחתיכות קטנות של 2 מילימטרים, תוך הקפדה לא לטחון את השרירים יותר מדי. לאחר מכן, דגרו בזהירות את שברי הרקמה ב -2.5 מיליליטר של תמיסת פרונאז 0.1% לבאר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות, בניעור עדין, כל 20 דקות.

כאשר צרורות הסיבים מציגים מראה משוחרר, הוסף 2.5 מיליליטר DMEM, בתוספת סרום סוסים ואנטיביוטיקה לכל באר, והעביר את הרקמות המעוכלות לצינורות חרוטיים בודדים של 15 מיליליטר. סובבו את תמיסות הרקמות, ושפכו את הסופרנטנטים. לאחר מכן, הוסף 5 מיליליטר מדיום לכל צינור, והומוגניזציה של הרקמה בעזרת פיפטה מפלסטיק של 10 מיליליטר.

סובב שוב את הרקמות והעביר את הסופרנטנטים לצינורות חרוטיים חדשים של 15 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו עוד 5 מיליליטר של מדיום לצינורות, וטריטו שוב את חלקי הרקמה עד שהשברים עוברים בקלות דרך הפיפטה.

לאחר צנטריפוגה נוספת, אסוף את הסופרנטנטים לתוך הצינורות המתאימים המתאימים, וסנן את מתלי התאים דרך מסננות של 40 מיקרומטר לצינורות בודדים של 50 מיליליטר. שטפו את המסננות עם 1 מיליליטר DMEM להתאוששות תאים מקסימלית. לאחר מכן, סובב את התאים. השעו מחדש את הכדורים במדיום טרי וספרו את התאים.

כדי לתרבית את תאי הלוויין המבודדים, לאחר מכן, יש לדלל את תרחיפי התאים ל-1.5 x 10³ תאים לכל 10 מיקרוליטר של מדיום תרבית. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של תאים על כל נקודת ג'ל מטריצה חוץ-תאית שהוכנה בעבר ודגר את הג'לים ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר שש שעות, הוסיפו בזהירות 400 מיקרוליטר של מדיום תרבית לכל נקודת ג'ל, והחזירו את השקופיות לחממה. לאחר שלושה ימים, התחל את התמיינות התאים בתוספת מדיום התרבות המתאים.