נוירוגנזה הנגרמת על ידי חומצה רטינואית באמצעות תאי קרצינומה עוברית של עכבר

קח תרחיף תאי קרצינומה עוברי של עכבר המסוגל להתמיין לסוגי תאים שונים.

תאי זרע על צלחת תרבית הידרופובית המכילה מדיה וחומצה רטינואית.

דגירה. משטחים הידרופוביים מונעים הידבקות תאים, וגורמים לתאים ליצור אגרגטים.

חומצה רטינואית נכנסת לאגרגטים של תאים, מפעילה מסלולי איתות וגורמת להתמיינות לתאי אב עצביים.

לאחר הדגירה, אסוף את אגרגטים של התאים.

השלך את המדיה.

הוסף מדיה המכילה חומצה רטינואית וזרע את האגרגטים על צלחת תרבית הידרופובית.

דגירה. חומצה רטינואית מאפשרת התמיינות תאית מתמשכת לנוירונים.

אסוף את האגרגטים והסר את המדיה.

הוסף אנזים פרוטאוליטי כדי לשבש הידבקויות תאים-תאים בתוך האגרגטים.

הוסף מדיה המכילה סרום כדי לעצור את הפעילות האנזימטית.

להפריד מכנית את האגרגטים וליצור מתלה עצבי.

צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט העשיר באנזימים.

השעו מחדש את הנוירונים במדיה וזרעו אותם על צלחת רב-בארות דביקה המכילה מדיה.

דגירה. נוירונים נצמדים לצלחת ומתבגרים, ומאריכים הקרנות ארוכות.

לייצור מצטבר, התחל בהוספת 10 מיליליטר של מדיום התמיינות בתוספת 5 מיקרוליטר RA לכלי תרבית לא מטופל של 100 מיליליטר. זרע מיליון תאים בצלחת התרבית, ודגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך יומיים על מנת לקדם היווצרות אגרגטים.

לאחר הדגירה, בעזרת פיפטה של 10 מיליליטר, שאפו את המדיום המכיל את האגרגטים והעבירו אותו לצינור של 15 מיליליטר בטמפרטורת החדר. המתן 1.5 דקות עד שהאגרגטים ישקעו בתחתית, ולאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט.

הוסף 10 מיליליטר של מדיום התמיינות טרי בתוספת 0.5 מיקרו-מולרי RA. זרעו בעדינות את האגרגטים בצלחת תרבית חדשה בגודל 100 מילימטר לא מטופלת, ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך יומיים.

כדי להתחיל, השתמש בפיפטה של 10 מיליליטר כדי להעביר את אגרגטי התאים לצינור של 15 מיליליטר. המתן 1.5 דקות בטמפרטורת החדר עד שהאגרגטים ישקעו בתחתית, ואז השליכו את הסופרנטנט. שטפו את האגרגטים בסרום וב-DMEM ללא אנטיביוטיקה. המתן עד שצבירי התאים יתייצבו בתחתית. השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 2 מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA.

דגרו את הצינור באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, והקישו כל שתי דקות כדי לשמור על התאים בתרחיף. לאחר מכן, הוסיפו 4 מיליליטר של אמצעי תחזוקה על מנת להפסיק את פעילות הטריפסין, והעבירו פיפטה למעלה ולמטה 20 פעמים באמצעות פיפטה של 1 מיליליטר.

לבסוף, צנטריפוגה את התאים ב -200 פעמים גרם וטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא ב-5 מיליליטר של מדיום תחזוקה. השתמש במונה תאים כדי לקבוע את מספר התא והמשך בציפוי התאים. לתאי צלחת, ראשית, הוסף 3 מיליליטר לבאר של מדיום תחזוקה לצלחת תרבית של שש בארות. לאחר מכן, זרעו את התאים בצפיפות של 500,000 לבאר. דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.