בדיקת מיאלינציה הנגרמת על ידי התמרה חוץ גופית עבור תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים

קח תרביות דבקות של תאי מבשר אוליגודנדרוציטים ראשוניים, או OPCs, במצע גידול.

הוסף וקטורים לנטי-ויראלים לבקרה לבאר הבקרה ובדוק וקטורי בדיקה, המקודדים חלבוני איתות המווסתים את המיאלינציה, לבאר הבדיקה, ולאחר מכן דגירה.

התאים מפנימים את הווקטורים, וה-RNA הנגיפי משועתק לאחור ל-DNA ומשולב בגנום המארח, ומבטא את חלבוני האיתות בתאי הבדיקה.

הכנס אנזימים לניתוק ה-OPCs מהמצע.

לנטרל את האנזימים והצנטריפוגות כדי להסיר את האנזימים.

הוסף את מצע הגידול והעביר את ה-OPCs לכיסויים בתוך מיקרו-פלטה עם גנגליון שורש גבי דבוק או נוירונים DRG. אפשרו ל-OPCs להתיישב.

ממלאים את הבארות במצע הגידול ודוגרים. אינטראקציה עם נוירוני DRG מעוררת התבגרות של OPC לאוליגודנדרוציטים.

חלבוני האיתות המבוטאים גורמים לאוליגודנדרוציטים ליצור מעטפות מיאלין סביב נוירוני ה-DRG.

להעריך את היווצרות מעטפת המיאלין הנגרמת על ידי חלבון איתות בתאי הבדיקה בהשוואה לתאים המומרים על ידי וקטור הבקרה.

עבור פרוטוקול זה, יש תאי מבשר אוליגודנדרוציטים ראשוניים, OPCs, שגודלו בצלחות של 10 סנטימטר עם 10 מיליליטר של מדיה SATO המכילה את גורמי הגדילה הבאים - CNTF, PDGF, NT3 ופורסקולין. התאים חייבים להיות מתורבתים במשך 24 שעות תחת 8% פחמן דו חמצני.

התחל בשאיבת המדיה והסר אותה לחלוטין. לאחר מכן, החלף אותו ב -10 מיליליטר מאותה מדיה עם גורמי הגדילה. הדביקו את ה-OPCs שלכם ב-lentivirus, ובטאו את החלבון המעניין על ידי הוספת הנפח הנדרש של הנגיף למדיה.

כמו כן, בלוחית OPC נפרדת, ערבב את וירוס הבקרה המבטא רק GFP למדיה. תרבו את התאים במשך 48 שעות נוספות, ואז אספו את ה-OPCs מהצלחות לזריעה על נוירוני ה-DRG המתורבתים.

ראשית, יש לשטוף כל צלחת עם 8 מיליליטר EBSS פעמיים. הרכיב 1 מיליליטר של טריפסין-EDTA 0.05% עם 9 מיליליטר EBSS חם. הוסף 5 מיליליטר מהטריפסין המדולל לכל צלחת. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך עד שתי דקות. נטרל את הטריפסין על ידי הוספת 5 מיליליטר של 30% FBS ב- EBSS.

לאחר מכן, בעזרת פיפטה של 10 מיליליטר, שטפו את ה-OPCs מפני השטח של הצלחת. סובב את הצלחת ברבע סיבוב בכל פעם כדי לאסוף את כל התאים. העבירו את מתלה התאים לצינור של 15 מיליליטר. צנטריפוגה של התאים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות בטמפרטורה של 180 גרם.

כעת, שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא במיליליטר של חומר SATO חם ללא גורמי גדילה, וספרו את התאים. לאחר מכן, הכינו את תאי העצב DRG שמתורבתים על כיסויי ה-22 מילימטר על ידי שאיבת המדיה לחלוטין מהצלחת שלהם.

לאחר מכן, זרע בעדינות 200,000 OPCs, טיפה, לכל כיסוי. נפח הזריעה חייב להיות פחות מ -200 מיקרוליטר לכל כיסוי. תן לתאים להתיישב מבלי להזיז את הצלחת. לאחר 10 דקות, יש למרוח על כל באר מיליליטר של חומר SATO חם. כעת צבעו מחדש את ה-OPCs האחיות הנותרות במדיית SATO המכילה גורמי גדילה. ניתן להשתמש בהם מאוחר יותר כדי לאמת את ביטוי החלבון המעניין.