בידוד ותרבית של נוירונים אוקולומוטוריים, טרוכליאריים ומוטוריים בעמוד השדרה מעובר עכבר

קח עכברה בהריון טרנסגנית והסר את הרחם בניתוח עם עוברים המכילים נוירונים מוטוריים בעלי תווית פלואורסצנטית.

העבירו את הרחם לצלחת עם חיץ קר כקרח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

השתמש באור נראה כדי לבודד את העוברים.

הסר את הפנים והזנב של העוברים וכוון אותם למצב שכיבה.

באמצעות אות הקרינה, בצע חתך במוח התיכון כדי לחשוף את גרעיני העיניים והטרוכלרים, המכילים נוירונים מוטוריים.

בודד את המוח התיכון המכיל את הגרעין.

פתח את הצד הגבי של המוח האחורי וחוט השדרה. בודד את חוט השדרה, כרת את שני הקצוות ואסוף את העמודים המכילים נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה.

טפל ברקמות שנאספו באנזימים כדי להפריד את מטריצת הרקמות. קצור את התאים הבודדים ובודד נוירונים עם תווית פלואורסצנטית באמצעות FACS.

הוסף מדיום תרבית לתאי העצב המבודדים, העביר את התאים למיקרו-צלחת מצופה מצע תרבית, ודגר, מה שמאפשר לתאים להיצמד ולגדול.

שמור על הנוירונים המוטוריים בתרבית.

התחל בקצירת עוברים חיוביים ל-Islet-1 EGF מעכברה בהריון כ-11.5 ימים לאחר ההפריה. רססו את הבטן ביסודיות באתנול, והסירו את הרחם בעזרת מספריים סטריליים ומלקחיים לתחבושת אגודל. שטפו בקצרה את הרחם ב-PBS סטרילי. לאחר מכן, העבירו אותו לצלחת החיתוך המלאה ב-PBS סטרילי מקורר מראש.

תחת האור הבהיר של המיקרוסקופ, הסר בזהירות את העוברים מהרחם באמצעות מספריים מיקרו-דיסקציה, מלקחיים לתחבושת אגודל ופינצטה מספר 5 של דומונט. לאחר מכן, השתמש בכף מיני-מחוררת סטרילית של מוריה כדי להעביר כל עובר לבאר נפרדת של צלחת בת 24 בארות מלאה במדיום פלואורסצנטי נמוך Hibernate E מקורר מראש בתוספת 1X V27.

תוך כדי שמירה על הצלחת על קרח, העבירו עובר אחד לצלחת דיסקציה סטרילית, וכסו אותו לחלוטין בתמיסת מלח מאוזנת סטרילית כקרח של האנק או HBSS. השתמש בפינצטה כדי להסיר את פני העובר והזנב מבלי לפגוע במוח האמצעי. לאחר מכן, הנח את העובר נוטה עם גפיים פרושות וזנב מצביע לכיוון קדמת המיקרוסקופ.

השתמש בפינצטה כדי לחתוך את גג החדר הרביעי על מנת ליצור פתח קטן. השתמשו בפתח זה כדי לחבר פינצטה לחלל שנוצר בין החדר הרביעי לגגו. נתח לאורך פני השטח הגביים של העובר הרוסטרלי לקליפת המוח ולרוחב לצלחת הרצפה ועמוד המנוע.

לאחר מכן, פתח את הרקמה המנותחת בצורה של ספר פתוח כדי לחשוף את גרעיני CN3 ו-CN4 החיוביים ל-GFP. הפרד בזהירות את המוח התיכון הגחוני מהעובר והסר רקמת קרום המוח בעזרת פינצטה וסכין מיקרו-דיסקציה.

נתח את גרעיני ה-CN3 וה-CN4 הדו-צדדיים החיוביים ל-GFP הרחק מלוח הרצפה ומרקמות אחרות שמסביב חיוביות ל-GFP, והקפידו להימנע מלגעת או לפגוע בנוירונים. אם אוספים גרעיני CN3 ו-CN4 נפרדים, חתכו לאורך המוח התיכון של שני הגרעינים הללו, והשתמשו בפיפטה P1000 כדי לאסוף את רקמת המוח התיכון הגחונית המנותחת עם מינימום HBSS.

הנח אותו בצינור מיקרו-צנטריפוגה מסומן בנפח 1.7 מיליליטר מלא במדיום דיסקציה. אחסן את השפופרת על קרח עד לדיסוציאציה. המשך לאגד מוח אמצעי גחוני מעוברים נוספים באותה צינור עד שהמספר הכולל יעמוד בדרישות הניסוי.

כדי לנתח את חוט השדרה הגחוני, שמור את העובר נוטה כשהראש פונה לקדמת המיקרוסקופ. החזק אותו עם פינצטה אחת והכנס את קצה הזוג השני לחלק הזנב הלא פתוח של החדר הרביעי. פתח את שאר המוח האחורי וחוט השדרה בגב על כל ההיקף הרוסטרוקאודלי של העובר. חותכים את רקמת הגב החל מהחדר הרביעי ופועלים לכיוון התעלה המרכזית של חוט השדרה הזנבי, באמצעות המלקחיים כמספריים.

לאחר מכן, החזיקו את העובר עם סט אחד של פינצטה וצבטו את דש רקמת הגב מכל צד עם הזוג השני. הסר את חוט השדרה הגחוני באמצעות סכין המיקרו-דיסקציה כדי לחדור ישירות מתחת ל-SMN החיובי ל-GFP, והרם את חוט השדרה הגחוני בתנועות דמויות מסור משני הצדדים.

חותכים את חוט השדרה לרוחב בגבול העליון של הגפה התחתונה, ומסירים את החלק המותני הצווארי. חותכים לרוחב ישירות מעל C1 היכן שהקרן הקדמית הראשונה החיובית ל-GFP בולטת. הניחו את הצד הגבי של חוט השדרה הגחוני כלפי מעלה והחזיקו אותו על ידי לחיצה על הרקמה השלילית ל-GFP בין עמודות ה-SMN החיוביות ל-GFP בעזרת פינצטה.

הסר את המזנכימה המחוברת הנותרת, DRGs וחוט השדרה הגבי על ידי חיתוך שני צידי עמוד ה-SMN החיובי ל-GFP בעזרת סכין המיקרו-דיסקציה. השתמש בפיפטה P1000 כדי לאסוף את רקמת חוט השדרה הגחונית המנותחת עם HBSS מינימלי, והנח אותה בצינור מיקרוצנטריפוגה מסומן בנפח 1.7 מיליליטר מלא במדיום דיסקציה. אחסן אותו על קרח עד לדיסוציאציה והמשך לאגור חוט שדרה גחוני מעוברים נוספים באותו צינור.

הוסף את הנפח המתאים של תמיסת פפאין לכל אחד מצינורות המיקרו-צנטריפוגה עם דגימות הרקמה המנותחות. דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, תוך ערבוב הצינורות כל 10 דקות על ידי תנועת אצבעות.

לאחר הדגירה, יש לשלש בעדינות כל מתלה שמונה פעמים בעזרת פיפטה P200. צנטריפוגה זה ב -300 פעמים גרם למשך חמש דקות. השעו מחדש את כדורי התא עם הנפח המתאים של תמיסת מעכב אלבומין אובומוקואיד על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה. חזור על הצנטריפוגה. לאחר מכן, הסר בזהירות את הסופרנטנט בעזרת פיפטה P1000. השעו מחדש את התאים בנפח המתאים של מדיום הדיסקציה. סנן את המתלים דרך מסנני תאים של 70 מיקרומטר.

לאחר מכן, השתמשו במיון FACS כדי לבודד תאים חיוביים ל-GFP שנותחו מ-CN3, CN4 ו-SMN. לדלל את תרחיפי התאים המבודדים עם מדיום תרבית נוירונים מוטוריים שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס לצפיפות המתאימה, ולהוסיף 200 מיקרוליטר של המתלה לבאר של צלחת 96 בארות מצופה PDL-laminin. תרבו את הנוירונים בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני, והקפידו לרענן את מדיום תרבית הנוירונים המוטוריים כל חמישה ימים.