התמיינות תאי גזע עצביים אנושיים לאבות עצביים ואסטרוציטים

התחל עם נוירוספרות שאינן דבקות, מצבור תלת מימדי של תאי גזע עצביים אנושיים במדיום מותנה שמקורו בתרבית תאים.

מדיום זה מכיל חומרים מזינים, גורמי גדילה ורכיבי מטריצה חוץ-תאיים השומרים על כדאיות התאים.

צנטריפוגה לאיסוף הנוירוספרות.

טפל בהם באנזימי טריפסין ו- DNase, ערבב את התוכן ואז דגירה.

טריפסין משבש את ההידבקות מתא לתא ומקל על ניתוק תאים, בעוד ש-DNase מפרק DNA חופשי כדי למנוע גוש תאים.

פיפטה את התוכן שוב ושוב ליצירת מתלה חד-תאי. לאחר מכן, הוסיפו מעכב טריפסין כדי לנטרל את פעילות האנזים.

צנטריפוגה והסירו את הסופרנטנט, ולאחר מכן השעו מחדש את התאים בתווך התפשטות המכיל גורמי גדילה עצביים.

זרע את מתלה התאים על כיסוי מצופה פולימר המונח בצלחת מרובת בארות. דגירה כדי לאפשר את היצמדות תאי הגזע לפולימר.

יתר על כן, בהתבסס על ספיגה של גורמי גדילה ספציפיים, תאי הגזע מתמיינים לאבות עצביים ואסטרוציטים, המוכנים להבשלה נוספת לסוגי תאים מיוחדים.

לאחר הכנת מדיום תרבית וציפוי תאי גזע עצביים אנושיים על פי פרוטוקול הטקסט, שלפו מהחממה את בקבוק התאים שיש לעבור, והכניסו אותו לארון הבטיחות הביולוגית או BSC. הטה בעדינות את הבקבוק, ואפשר לתאים לשקוע לתחתית המדיום המאוחסן.

העבירו 10 מיליליטר של מדיום לשתי מנות של 5 מיליליטר לצינור נקי של 15 מיליליטר שכותרתו "CM" למדיום מותנה. הקפד לא לשאוב אף אחד מהתאים שהתיישבו בבקבוק. העבירו 3 מיליליטר של מדיום מצינור ה-CM לצינור של 15 מיליליטר שכותרתו "תמיסת מעכב טריפסין". לאחר מכן, הנח את צינור ה-CM בצד.

לאחר מכן, הסר את 5 מיליליטר המדיום והתאים שנותרו בבקבוק T75, והנח אותו בצינור נקי של 15 מיליליטר שכותרתו "תאים". לאחר מכן, בעזרת פיפטה סרולוגית ונפחים של 3.5 מיליליטר של ה-CM, שטפו את בקבוק ה-T75 פעמיים, והעבירו את שטיפת ה-CM לתוך צינור ה'תאים'. זה יסיר את כל הנוירוספרות מבקבוק T75.

צנטריפוגה של צינור 'התאים' בטמפרטורה של 100 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. בזמן שהתאים מסתובבים, השיגו את תמיסת הגלוקוז DPBS שהוכנה קודם לכן מאמבט המים של 37 מעלות צלזיוס, והוסיפו את הכמות המתאימה של טריפסין ו-DNase.

לאחר שצינור ה'תאים' הפסיק להסתובב, הסר את כל החומר הבינוני המותנה והעביר אותו לצינור ה-CM. הוסף תמיסת טריפסין לכדור התא בצינור של 15 מיליליטר, והשתמש בפיפטה של 5 מיליליטר כדי לפיפטה למעלה ולמטה בערך 5 עד 10 פעמים. סגרו את מכסה הצינור, ודגרו אותו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לשפופרת מעכב הטריפסין, הוסף את הנפח המתאים של מעכב טריפסין, והוסף את אותו נפח תמיסה ששימש לתמיסת הטריפסין. לאחר מכן, הניחו את תמיסת מעכב הטריפסין באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד לצורך.

לאחר הדגירה, פיפטה את התאים למעלה ולמטה 5 עד 10 פעמים. לאחר מכן, דגרו את הדגימה באמבט המים של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות נוספות. לאחר הדגירה של התאים, פיפטה את התאים למעלה ולמטה עד שהכדורים מתנתקים לחלוטין. לאחר מכן, הוסיפו מיד את תמיסת מעכב הטריפסין, והעבירו את תרחיף התא למעלה ולמטה 10 פעמים.

כדי לספור את מספר התאים בתרחיף, פיפטה 15 מיקרוליטר של תערובת טריפאן כחולה על סירת משקל קטנה, והוסף 5 מיקרוליטר של תרחיף התאים. פיפטה למעלה ולמטה 3 עד 5 פעמים לערבוב. לאחר מכן, העבירו 10 מיקרוליטר של תרחיף התאים הכחולים של טריפן משני צידי המוציטומטר, מכוסה בכיסוי זכוכית.

התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ אור וספור את המספר הכולל של התאים בכל אחת מארבע רשתות הפינה. לאחר מכן, חבר את המספרים האלה יחד. לאחר חישוב מספר התאים על פי פרוטוקול הטקסט, הוסף נפח של תרחיף תאים לכל בקבוק T75 כדי לקבל 5 x 10⁶ תאים לבקבוק.

אם הנפח נמוך מ -5 מיליליטר, הוסף מדיום מותנה נוסף עד 5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של מדיום DFHGFPS חדש המכיל גורמי גדילה לבקבוק. ודא שהבקבוק מסומן בסוג התאים, התאריכים, מספר התאים בבקבוק ומספר המעבר. אם תרצה, דגר על התאים בשלב זה.

כדי לצלחת HNSCs דביקים, יום לפני המעבר, נקה את ה-BSC כפי שמוסבר בפרוטוקול הטקסט, והשתמש במלקחיים כדי להניח כיסויי זכוכית סטריליים בודדים בגודל 12 מילימטר לבארות של צלחת של 24 בארות. מצפים את הבארות בכיסויים ב-250 מיקרוליטר לבאר של 0.01% פולי-D-ליזין או PDL במים סטריליים, ודוגרים את הצלחות ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. הסר את ה- PDL מהבארות ולאחר מכן צפה אותם ב -1 מיקרוגרם לסנטימטר מרובע של למינין DPBS.

דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. אם אין צורך למחרת, עטפו פרפילם סביב שולי הצלחת כדי לאטום אותה ואחסנו אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסר כל תמיסת למינין עודפת מהבארות באמצעות שאיפה, והשתמש ב -0.5 מיליליטר DPBS כדי לשטוף את הבארות פעם אחת. לאחר מכן, זרעו את התאים לכל באר בצפיפות של 0.6 עד 1 x 10⁵ תאים לסנטימטר מרובע.