יצירת אורגנואידים מוחיים מסוג המוח הקדמי מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם

התחל עם צלחת באר עם חיבור נמוך המכילה תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם או iPSCs במדיום תאי גזע בתוספת מעכב רו-קינאז.

המעכבים נכנסים לתאים, חוסמים את אנזימי הרו-קינאז ושומרים על כדאיות התאים. זה מקדם היווצרות של אגרגטים iPSC.

החלף את המדיום במדיום תאי גזע כדי לאפשר לאגרגטים לצמוח. העבירו אותם לכלי תרבית עם התקשרות נמוכה עם מדיום אינדוקציה קליפת המוח.

המרכיבים של מדיום זה גורמים ל-iPSCs להתמיין לתאים נוירו-אקטודרמליים, קודמן עצבי.

העבירו כל אגרגט נוירואקטודרמלי לסרט עם בארות רדודות.

החלף את המדיום במטריצת קרום מרתף ודגר כדי לאפשר התמצקות מטריצה ולכידת אגרגטים.

העבירו את האגרגטים המשובצים במטריקס לצלחת המכילה מדיום אינדוקציה קליפת המוח ודגרו בתסיסה.

עם הזמן, התאים הנוירואקטודרמליים מנצלים את גורמי ההתמיינות ומתפתחים לתאים נוירו-אפיתליים.

שנה את המדיום למדיום התמיינות אורגנואידי, המאפשר לתאים להתבגר לסוגי תאים מיוחדים יותר, וליצור אורגנואיד מוחי הדומה לקליפת המוח הקדמית.

כדי ליצור אגרגטים של תאי גזע פלוריפוטנטיים, כאשר תרביות תאי הגזע מגיעות למפגש של 70% עד 90%, הוסף 500 מיקרוליטר של מגיב דיסוציאציה של תאים לבאר אחת של צלחת התרבית בת שש הבארות כדי לנתק את התאים.

תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, המותאמים לתנאי תרבית חד-שכבתית, הם סוג תאים טוב ליצירת אגרגטים מכיוון שהם פחות מועדים למוות תאים הנגרם על ידי לחץ במהלך הליך הדיסוציאציה והצבירה.

לאחר 5 עד 10 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס, הקש בעדינות על הצלחת והשתמש ב-2 מיליליטר DMEM/F-12 כדי לשטוף את התאים מתחתית הבאר. העבירו את תרחיף התא שנוצר לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר, והביאו את נפח תמיסת התא עד 10 מיליליטר עם יותר מדיום DMEM/F-12.

לאחר הספירה, העבירו 4.5 פעמים 10 לתאים השלישיים לכל תאי גזע פלוריפוטנטיים לתוך צינור חדש של 15 מיליליטר, ואספו את התאים על ידי צנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה בנפח המתאים של מדיום תאי גזע פלוריפוטנטיים, בתוספת מעכב ROCK מיקרו-מולרי 50 כדי להשיג 4.5 x 10³ תאים לכל 150 מיקרוליטר של ריכוז בינוני.

לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטר תאים לבארות בודדות של צלחת U תחתונה נמוכה של 96 בארות, והנח את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לניטור אינדוקציה של נוירואקטודרם קדמי, השתמש במיקרוסקופ תרבית רקמות כדי להתבונן מקרוב בשינויים המורפולוגיים של אגרגטים של תאי גזע פלוריפוטנטיים מדי יום בהגדלה נמוכה.

ביום הראשון יש להקפיד על אגרגטים של תאים עם גבולות ברורים. ביום השני, שאפו בזהירות כ-2/3 מהמדיום מבלי להפריע לאגרגטים של התאים בתחתית כל באר, והחליפו את המדיום המושלך ב-100 מיקרוליטר של מדיום תאי גזע פלוריפוטנטיים טריים.

בין ארבעה לשישה ימים לאחר מכן, כאשר אגרגטים של התאים מגיעים לקוטר של 350 עד 450 מיקרומטר ומציגים קצוות חלקים, השתמש בקצה פיפטה שונה של 100 מיקרוליטר כדי להעביר עד 20 אגרגטים ללוחית תרבית אחת של 6 סנטימטר עם חיבור נמוך המכילה 5 מיליליטר של מדיום אינדוקציה קליפת המוח.

החלף את מדיום האינדוקציה בקליפת המוח במדיום טרי אחת לשלושה ימים, תוך ניטור המורפולוגיה של האגרגטים מדי יום תחת היעד פי 4. לאחר ארבעה עד חמישה ימים במדיום האינדוקציה בקליפת המוח, קצוות אגרגטי התאים צריכים להתחיל להתבהר על פני השטח, מה שמעיד על התמיינות נוירו-אקטודרמלית, והארגון הרדיאלי של אפיתל פסאודוסט אמור להופיע

כדי להטמיע את האגרגטים הנוירו-אקטודרמליים בפיגום מטריצה, מלאו תמצית קרום בסיס על קרח למשך שעתיים-שלוש. בזמן שהתמצית מפשירה, השתמש במספריים סטריליים כדי לחתוך סרט פרפין מפלסטיק לריבוע אחד של 4 על 4 ס"מ לכל 16 אורגנואידים, והנח כל פיסת סרט על מגש קצה מיקרופיפטה ריק של 100 מיקרוליטר.

לחץ על סרט הפרפין בקצה אצבע עטוי כפפה כך שיופיעו גומות קטנות, ונקה את הסרט עם 70% אתנול. לאחר הקרנת UV בארון בטיחות ביולוגית סגור וסטרילי למשך 30 דקות, השתמש בקצה פיפטה שונה של 100 מיקרוליטר עם פתח של 1 ו-1/2 עד 2 מילימטר כדי להעביר כל אגרגט תאים לגומה אחת בסרט.

לאחר שכל האגרגטים הועברו, השתמש בקצה פיפטה לא חתוך של 100 מיקרוליטר כדי לשאוב בזהירות את המדיום מכל גומה, והוסף 40 מיקרוליטר של תמצית קרום בסיס לא מדולל לכל אגרגט תא.

היזהר לא לפגוע באורגנואידים על ידי מניפולציה גסה או שאיפה לקצה הפיפטה, מכיוון שהדבר יפגע בנוירואפיתל המתפתח.

השתמש בקצה הפיפטה כדי למקם את האגרגטים באמצע כל טיפה, והשתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר בזהירות את יריעת סרט הפרפין מפלסטיק לצלחת פטרי בגודל 10 סנטימטרים. מניחים את המנה בחממה למשך 15 עד 20 דקות.

בזמן שהתמצית מתמצקת, הוסף 5 מיליליטר של מדיום אינדוקציה קליפת המוח הטרי לכלי תרבית חיבור נמוך של שישה סנטימטרים. בתום הדגירה, הפוך את יריעת סרט הפרפין, והשתמש במלקחיים סטריליים כדי לסחוט בעדינות עד 16 טיפות פולימריזציה לכל צלחת של 6 סנטימטרים. לאחר מכן, החזר את האגרגטים לחממת תרבית התאים.

למחרת, העבירו את צלחות התרבית האורגנואידית לשייקר תרבית תאים מתנדנד המוטה בזווית של 5 מעלות ב-14 סל"ד בתוך אינקובטור תרבית תאים עם ניטור מיקרוסקופ אור יומי עד שהאגרגטים מגיעים לשלב ההתמיינות המעניין.