בידוד תאי גליה אנטריים מהתת-רירית והלמינה פרופריה של עכבר

קחו קטע מעי דק של עכבר שהופשט בעבר מהשריר האורכי ומקלעת המיאנטרית, שכבות המכילות נוירונים מעיים ותאי גליה.

חותכים את הרקמה ומניחים אותה במאגר המכיל EDTA. דגירה עם נדנדה.

EDTA משבש את הצמתים בין תאים, ומנתק את רירית האפיתל מהלמינה פרופריה והתת-רירית הבסיסית, שכבות רקמת חיבור המכילות תאי גליה אנטריים.

פיפטה שוב ושוב כדי לעקור את תאי האפיתל.

סנן דרך מסננת תאים והשליך את הזרימה.

העבירו את הרקמה למאגר דיסוציאציה לא אנזימטי ודגרו אותה בעזרת נדנדה. מאגר הדיסוציאציה משחרר את הלמינה פרופריה ואת המטריצה החוץ-תאית התת-רירית, ומנתק את התאים.

פיפטה שוב ושוב כדי לנתק עוד יותר את התאים.

סנן דרך מסננת תאים כדי לאסוף את התאים.

צנטריפוגה והשעיית התאים במאגר.

קח בארות מצופות חלבון הידבקות המכילות מצע גידול גליה וצלח את התאים.

הציפוי מקל על הידבקות התאים, בעוד שגורמי הגדילה מקדמים באופן סלקטיבי את התפשטות תאי הגליה, ויוצרים למינה פרופריה ותרבית תאי גליה תת-רירית.

כדי להסיר את רירית האפיתל, ראשית, השתמש במספריים עדינים כדי לחתוך את המעיים לחתיכות של כ-0.5 סנטימטר ולאסוף את החתיכות ב-30 מיליליטר של תמיסת EDTA/HEPES/DPBS קרה כקרח. נדנד את התמיסה המכילה רקמות ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בכ-60 הטיות לדקה.

הרטיבו מראש פיפטה מפלסטיק של 5 מיליליטר על ידי פיפטינג של מאגר EDTA/HEPES/DPBS למעלה ולמטה פעם אחת, ולאחר מכן השתמשו בפיפטה הלחה מראש כדי לשבש את הרקמה ואת תרחיף החיץ 20 פעמים כדי לעקור את רירית האפיתל.

אסוף את הרקמה על ידי יציקת התערובת דרך מסננת תאי ניילון של 100 מיקרון, והשתמש במלקחיים מחטיים כדי למקם את הרקמה שנשמרה במסננת לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי חדש של 50 מיליליטר המכיל 30 מיליליטר של EDTA/HEPES/DPBS קר כקרח. חזור על הדגירה של EDTA/HEPES/DPBS פעם שנייה על ידי נדנוד הרקמה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בכ-60 הטיות לדקה כדי להסיר רירית אפיתל נוספת.

בצע טריטורציה עדינה באמצעות פיפטה לחה מראש של 5 מיליליטר. הרקמה נוטה להיצמד לחלק הפנימי של הפיפטה ככל שמסירים יותר מהאפיתל

נדרש טריטורציה עדינה בשלב זה, מכיוון שתאי הגליה האנטרי שבירים יותר.

אוספים את הרקמה לאחר הדגירה השנייה על ידי יציקת התערובת דרך מסננת תאי ניילון של 100 מיקרון, וזורקים את הזרימה. הזרימה השנייה צריכה להיות פחות עכורה באופן ניכר מהראשונה. חזור על דגירות ה-EDTA של 10 דקות עד שהתמיסה כמעט צלולה.

העבר את הרקמה ממסננת הניילון לצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מיליליטר המכיל 5 מיליליטר מתמיסת התא הזמינה מסחרית. לאחר מכן, נדנדו במשך 25 עד 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יש למשוך בעדינות 10 פעמים כדי לנתק את תאי הגליה האנטרי מהלמינה פרופריה, ואז לסנן דרך מסנן של 40 מיקרון ולאסוף את המסנן לתוך צינור נקי של 50 מיליליטר.

שוטפים את הרקמה על פילטר הניילון עם 1 מיליליטר DPBS. השליכו את הרקמה והעבירו את 5 עד 6 מיליליטר הפילטר לצינור צנטריפוגה חרוטי נקי של 15 מיליליטר. סובב את המסנן ב -2,000 פעמים גרם בצנטריפוגת דלי מתנדנדת למשך חמש דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס.

השעו מחדש את הגלולה המכילה תאי גליה בלפחות 1 מיליליטר של מאגר השעיה מחדש על ידי פיפטינג עדין של הגלולה למעלה ולמטה עם קצה הפיפטה של 500 מיקרוליטר מבלי להכניס בועות. לבסוף, צלחו את תאי הגליה האנטרי על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של תרחיף התאים לכל באר של צלחת מצופה למינין של 6 בארות או 100 מיקרוליטר לכל באר של צלחת של 12 בארות המכילה מצע גידול גליה.