שיטה לבידוד יחידות נוירו-וסקולריות ממוח חולדה

התחילו עם מכתש זכוכית קר המכיל רקמת מוח קליפת המוח של חולדות, שהיא השכבה החיצונית ביותר של המוח.

הוסף מאגר מיקרו-כלי דם במוח או BMB, המכיל מעכבי פרוטאז.

כעת, הזיזו את העלי למעלה ולמטה כדי לנתק את הרקמה.

תסיסה זו משחררת את היחידות הנוירו-וסקולריות, או NVUs, הכוללות מיקרו-כלי דם, פריציטים, נוירונים ותאי גליה. מעכבי הפרוטאז חוסמים את הפרוטאזות המשוחררות, ומגנים על כלי הדם הזעירים.

מעבירים את התערובת לצינור.

הוסף תמיסת פוליסכריד צפופה. השתמש במערבולת כדי לערבב את התמיסה עם תכולה אחרת באופן אחיד.

צנטריפוגה. הפוליסכרידים הצפופים מאפשרים שקיעה של NVUs, שהם צפופים יותר מפסולת רקמות.

השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את ה-NVUs ב-BMB המכילים מעכב פרוטאז ותמיסת פוליסכריד.

השתמש במערבולת כדי לערבב את התוכן.

חזור על תהליך הצנטריפוגה. השליכו את ה-supernatant כדי להסיר שאריות פסולת.

השעו מחדש את ה-NVUs ב-BMB ואחסנו אותם לניתוח נוסף.

הנח את רקמת המוח בקליפת המוח במכתש זכוכית צונן. לאחר מכן, הוסף 5 מיליליטר BMB עם קוקטייל מעכב פרוטאז. באמצעות הומוגנייזר כוח עילי, הכניסו עלי לתוך המרגמה והומוגניזציה של רקמת המוח באמצעות 15 משיכות למעלה ולמטה ב-3,700 סל"ד. לאחר מכן, שפכו את ההומוגנאט לצינורות צנטריפוגה מסומנים. בין הדגימות, השתמש ב-70% אתנול לניקוי העלי.

כדי לבצע צנטריפוגה, הוסף 8.0 מיליליטר של תמיסת דקסטרן 26% לכל צינור צנטריפוגה מסומן המכיל הומוגנט מוח. הפוך את הצינור פעמיים ולאחר מכן מערבל היטב את הדגימה. בצע את המערבולת של כל דגימה באמצעות מספר זוויות כדי להבטיח ערבוב יסודי של תמיסת מוח הומוגנית עם תמיסת דקסטרן 26%. צנטריפוגה את הדגימות ב-5,000 גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-5.0 מיליליטר BMB עם קוקטייל מעכב פרוטאז. לאחר מכן, מערבל את הגלולה כדי להבטיח ערבוב יסודי. לאחר מכן, הוסף 8.0 מיליליטר של 26% דקסטרן לכל צינור צנטריפוגה ומערבולת כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן, צנטריפוגה שוב את הדגימות.

בעזרת בקבוק ואקום ופיפטת זכוכית, שאפו את הסופרנטנט וודאו שהכדור המכיל את כלי הדם במוח לא יופרע. השעו מחדש את הגלולה ב-BMB עם מעכב פרוטאז ולאחר מכן 26% דקסטרן פעמיים נוספות. לאחר הצנטריפוגה הסופית, הוסף 5.0 מיליליטר BMB לכל גלולה ומערבולת כדי להשעות מחדש את הדגימה.