טכניקה לקצירת וניתוק גרעיני שורש גבי עבור תרביות עצביות

קח קטע מעמוד השדרה של חולדה וחלקו אותו כדי להסיר את חוט השדרה.

נתק את גרעיני השורש הגביים, או DRGs, מקבץ של נוירונים המוקפים בתאי גליה לווייניים, או SGCs.

הנח את ה-DRGs במצע גידול. הסר את שורשי העצבים כדי להפחית את זיהום SGC.

טפלו בקולגנאז כדי לפרק את מטריצת הרקמות ושטפו כדי להסיר את האנזימים.

הכנס טריפסין כדי לשבש חיבורים בין-תאיים. הוסף סרום המכיל חלבונים המנטרלים טריפסין.

הוסף את מצע הגידול ונתק מכנית את הרקמה. סנן את התרחיף כדי לבודד תאים בודדים וצנטריפוגה להסרת פסולת רקמות.

השעו מחדש את התאים כדי לשכב אותם על מדיום שיפוע צפיפות, וצנטריפוגה.

נוירונים בעלי צפיפות גבוהה יותר מתיישבים בתחתית, מה שמקל על הפרדת SGCs.

השעו מחדש את הנוירונים במדיום תרבותי. העבירו אותם לבאר מצופה מצע תרבית, המאפשרת חיבור תאים.

תוסף עם גורמי גדילה עצביים להישרדות עצבית.

כדי להשיג את נוירוני ה-DRG לאחר קצירת חוט השדרה, התחל בהסרת כל חלקי הגב ולאחר מכן, השתמש במספריים כירורגיים סטריליים וחדים כדי לחלק את עמוד השדרה לשניים לאורך ציר האורך, תוך חשיפת רקמת החבל. חתכו את עמוד השדרה לשני מקטעים קטנים יותר מתחת לגובה כלוב הצלעות, ולאחר מכן השתמשו במלקחיים עדינים כדי להסיר בעדינות את כל רקמת הטבור, תוך הקפדה לא למשוך ולהסיר את שורשי ה-DRG, המופיעים כחוטים לבנים היוצאים ישירות מהתעלות.

לאחר הסרת כל רקמת הליבה, השתמש במלקחיים עדינים מאוד כדי למשוך את כל שורש ה-DRG, להגיע עמוק לתוך תעלות החוליות ולהקפיד לא לפגוע בשורשי הגרעין. הכניסו את ה-DRG לצלחת פטרי בגודל 60 מילימטר רבוע המכילה 3 עד 4 מיליליטר של מדיום F-12 של Ham, בתוספת אנטיביוטיקה. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ מנתח, השתמש במלקחיים סטריליים ובאזמל כדי לנקות את כל שורשי העצבים העודפים המקיפים את הגרעינים כדי להפחית את זיהום תאי הלוויין.

לאחר מכן, העבירו את ה-DRG לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר רבוע המכילה 1.8 מיליליטר של מדיום F-12 טרי, והוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת מלאי קולגנאז מסוג 4. דגרו את ה-DRG למשך שעה, ולאחר מכן שאפו בזהירות את המדיום בעזרת פיפטה מזכוכית, תוך הקפדה לא לשאוף או לפגוע ב-DRG.

חזור על שלב הקולגנאז ושטוף את ה-DRG עם מדיום F-12. לאחר הכביסה השנייה, הוסף לתאים 1.8 מיליליטר של מדיום F12 ו -200 מיקרוליטר טריפסין, הסר את הטריפסין והוסף 1 מיליליטר של מדיום בתוספת 500 מיקרוליטר FBS כדי לעצור את התגובה האנזימטית. לאחר מכן, שאפו את המדיום ושטפו בעדינות את ה-DRG עם מדיום F-12 שלוש פעמים כדי להסיר את כל עקבות הסרום.

כעת, האכילו את התאים ב-2 מיליליטר של מדיום F-12 טרי והשתמשו בפיפטה מזכוכית כדי להעביר בזהירות את תרחיף התא לצינור של 15 מיליליטר. פיפטה למעלה ולמטה 8 עד 10 פעמים כדי לנתק בעדינות את הנוירונים, ואז לאפשר לכדור להצטבר בתחתית הצינור. כאשר הגלולה מתייצבת, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש, והוסיפו 2 מיליליטר של מדיום F12 טרי לגלולה, וחזרו על הדיסוציאציה המכנית והעברת המדיום עד שהתרחיף הופך הומוגני.

לאחר מכן, יש לשלש את תרחיף התא שלוש עד ארבע פעמים, ולאחר מכן לסנן את התרחיף ההומוגני שנוצר דרך מסננת תאים של 100 מיקרון לתוך צינור חדש של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את התאים בצינור של 15 מיליליטר. בזמן שהם מסתובבים, פיפטה לאט אלבומין טרי של 15% סרום בקר במורד החלק הפנימי של שפופרת של 15 מיליליטר המוחזקת בזווית של 45 מעלות כדי ליצור שובל חלבון הדרגתי תוך שימוש במספרים על הצינור כהתייחסות למסלול היוצר.

לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנט מהתאים, שמרו את 500 המיקרוליטרים האחרונים להשעיה מחדש של הגלולה, והוציאו לאט את התאים לאורך נתיב החלבון לתוך הצינור החדש. לאחר סיבוב התאים שוב, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום BS שונה וזרעו את התאים בנפח קטן של מדיום בצלחת של 24 בארות למשך שעתיים. כאשר התאים התחברו, הוסף מדיום BS טרי בתוספת 50 ננוגרם למיליליטר של גורם גדילה עצבי.