בידוד וטיפוח פריציטים מוחיים של עכברים

הוסף חיץ לרקמת המוח של העכבר והומוגניזציה שלו כדי לשחרר תאים וכלי מיקרו.

לאחר מכן, הוסף את תמיסת BSA-dextran להומוגנאט. מערבבים וצנטריפוגה כדי להפריד בין הרכיבים. השליכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את המיקרו-כלים במאגר, והעבירו אותם דרך מסנן, והסירו כלים גדולים יותר.

כעת, צנטריפוגה את המסנן והסר את הסופרנטנט. השעו מחדש את המיקרו-כלי במאגר המכיל DNAses.

הוסף אנזימים פרוטאוליטיים כדי לשחרר תאי אנדותל ופריציטים.

DNases מפרקים DNA.

הוסיפו בופר המכיל BSA כדי לעצור את פעילות האנזים. צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את התאים במדיה וצלחו אותם על צלחת מרובת בארות מצופה מטריצת מרתף. דגירה, קידום הידבקות תאים.

החליפו מדיה באופן קבוע.

תאי אנדותל יוצרים שכבה אחת ותומכים בצמיחת פריציטים.

מעבר תאים לאחר מכן במדיה פריציטית על צלחת מרובת בארות מצופה ג'לטין מקדם צמיחת פריציטים תוך ביטול תאי אנדותל.

התחל בהנחת המוח מעכבר C57 שחור 6 זכר ספציפי בן ארבעה עד שישה שבועות ללא פתוגנים על מגבון סטרילי, יבש ונטול מוך ושימוש במלקחיים מעוקלים כדי להסיר את המוח הקטן, הסטריאטום והעצבים העורפיים. השתמש בצמר גפן כדי להסיר את כל קרומי המוח הנראים לעין, ולהפוך את רקמת המוח. פתח את האונות במשיכות קלות כלפי חוץ והסר את כל כלי הדם הגלויים. לאחר מכן, הניחו את רקמת המוח נטולת קרומי המוח בצלחת פטרי בגודל 100 מילימטר המכילה 15 מיליליטר של מאגר כביסה קר B.

כדי להומוגניזציה של הרקמה, העבירו את דגימת המוח לתוך צינור מרגמה של מטחנת רקמות Dounce, והוסיפו 3 עד 4 מיליליטר של מאגר כביסה B לשפופרת. השתמש בעלי רופף כדי לטחון את הרקמה 55 פעמים. לאחר מכן, שטפו את העלי עם מאגר כביסה B, וטחנו את תמיסת הרקמות עם עלי הדוק 25 פעמים. בתום ההומוגניזציה, יש להוציא באותה מידה את התרחיץ בין שני צינורות של 50 מיליליטר ולהוסיף פי 1.5 מהנפח של דקסטרן אלבומין בסרום בקר קר. לאחר מכן, יש לנער במרץ את הצינורות כדי לערבב את התרחיץ.

כדי לבודד את מקטע כלי הדם, משקעים את התאים על ידי צנטריפוגה, ומעבירים את הסופרנטנטים לשני צינורות חדשים. אחסן את הגלולה במאגר כביסה B על קרח. השעו מחדש את הכדורים בשלושה מיליליטר של מאגר כביסה קר B על קרח.

צנטריפוגה את הסופרנטנטים שנקטפו, וחזור על שלב זה פעם נוספת. השליכו את הסופרנטנטים, והשעו מחדש את הכדורים ב-3 מיליליטר של מאגר כביסה B. לאחר מכן, אסוף את הכדורים התלויים והביא את הנפח הסופי של מתלי התאים המאוגדים ל-10 מיליליטר עם מאגר כביסה קר טרי B.

יתר על כן, נתק את התאים עם פיפטה של 10 מילימטר שש פעמים עד שלא נראים גושי כדורים שנותרו, והשתמש במכלול מסנן ואקום ובמסננת רשת ניילון כדי לסנן את מתלה התא. מניחים את המסננת בצלחת פטרי, ומנקים את הרשת עם מאגר כביסה B טרי וגירוד כדי לשחזר נימים. לאחר מכן, בצע סינון שני עם פילטר טרי.

חלקו את המסנן באופן שווה בין שני צינורות ואספו את התאים באמצעות צנטריפוגה. לאחר השלכת הסופרנטנטים, אסוף את הכדוריות לתוך שפופרת אחת המכילה חוצץ כביסה B מחומם מראש עם אנזימים והוסף קולגנאז מחומם מראש לשפופרת. הנח את הצינור באמבט מי שולחן רועד למשך 33 דקות בדיוק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני הפסקת התגובה עם 30 מיליליטר של מאגר כביסה קר B.

אספו את התאים על ידי צנטריפוגה, והשליכו בזהירות את הסופרנטנט. השעו במהירות אך בזהירות את הגלולה במאגר הכביסה B שש פעמים וצנטריפוגה שוב את המתלה. לאחר השלכת הסופרנטנט, יש להשעות מחדש את הגלולה במיליליטר של מדיום DMEM שלם ולזרוע 2 מיליליטר של תרחיף תאים ב-DMEM מלא בתשע בארות של שלוש צלחות שש בארות מצופות מטריג'ל.

מניחים את תרביות התאים בחממה סטרילית של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות לפני שמסירים בזהירות את הפסולת מכל באר, ומוסיפים מדיה DMEM טרייה. לאחר 48 שעות, החלף את המדיום בכל באר כל 48 שעות. ביום 8 עד 10, כאשר התאים מגיעים ל-100% מפגש, העבירו את התאים במדיום תרבית הטפילים לצלחות חדשות של שש בארות מצופות ג'לטין והחזירו את התאים לחממת תרבית התאים למשך 6 עד 7 ימים נוספים עם מעקב.