תיוג סמנים של פני השטח של תאים עצביים עם Azidosugar תוך כדי גידול משותף עם תאי אנדותל

התחל בהוספת תרחיף תאי אנדותל של מוח עכבר לתוספת הממברנה החדירה של צלחת טרנסוול.

הוסף מדיום גידול לתחתית היטב ודגר.

גורמי הגדילה והחומרים המזינים במדיום עוזרים לתאים לצמוח כשכבה אחת.

הסר את המדיום מהתחתית היטב ומהתוספת.

שטפו את המשטחים הפנימיים והחיצוניים של התוספת כדי להסיר פסולת.

הוסף מדיום דביק לתוספת, והעביר את התוספת לבאר מצופה מטריצה המכילה תאי גזע עצביים ראשוניים בקליפת המוח ותאי אב, או NSPCs, ודגירה.

הוסף אזידוסוכר, אנלוגי מבשר חומצה סיאלית לא טבעית, הן לתאי האנדותל והן ל-NSPCs, ודגירה.

הציטוקינים והכימוקינים המופרשים על ידי תאי אנדותל מקדמים את צמיחת ה-NSPCs לשיבוטים גדולים דמויי יריעות.

סוכרים אזידו-סוכרים משתלבים במבנים הסיאלוגליקניים על פני תא ה-NSPC, ומסמנים את הגליקופרוטאין. זה מאפשר זיהוי של חלבוני פני התא על ה-NSPCs המורחבים.

כדי להכין את תאי האנדותל, השעו מחדש כדור תא BEND3 מצלחת פטרי של 0.10 סנטימטר במפגש של 90% עם 9 מיליליטר של מדיום תאי BEND3. הוסף 1 מיליליטר מתרחיף התא לתוספת תמיכה חדירה אחת. הוסף עוד 2 מיליליטר בינוני BEND3 לבאר בתא התחתון של המטריצה. המשיכו לתרבית התאים למשך יום אחד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.

יום לאחר ציפוי התאים בתוספות, שאפו בעדינות את המדיום, תחילה מהתא התחתון ולאחר מכן מהתוספות. שטפו את פני התוספות שלוש פעמים עם DMEM מחומם מראש. שטפו את המשטח החיצוני של התוספות על ידי שטיפה עם DMEM מחומם מראש. לאחר מכן, הוסף 1 מיליליטר AM מחומם מראש לתוספת אחת. העבירו את התוספות לבארות עם תאים ראשוניים בקליפת המוח. דגרו על התרבות המשותפת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 12 שעות.

ממיסים AC₄ManNAz ב-DMSO כדי להשיג ריכוז מלאי של 200 מילימולר. אחזר את צלחת התרבות המשותפת של האנדותל העצבי מהחממה. הוסף 1 מיקרוליטר ממלאי Ac₄ManNAz לכל תא תחתון ו-0.5 מיקרוליטר לכל תוספת לתרבית המשותפת. תרבית התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 5 ימים. בזמן שהתאים מתרבים, הוסיפו 100 מיקרוליטר RM לכל תוספת ו-200 מיקרוליטר RM לכל תא תחתון כדי להזין מחדש את תאי האנדותל והעצבים כל יומיים.