טכניקה לבידוד גרעינים מתאים לא עצביים בבליטה המשוננת בהיפוקמפוס

קח פיתול משונן, ממוח עכבר במאגר הומוגניזציה קר.

להתנתק מכנית כדי לשחרר נוירונים, גליה ותאי גזע.

חומר הניקוי העדין של המאגר מחלחל לתאים, ומשחרר גרעינים ואברונים אחרים.

מסננים את ההומוגנאט כדי להסיר פסולת רקמות. לאחר מכן, צנטריפוגה, הסר את האברונים והשהה מחדש את מאגר ההומוגניזציה כדי ליז תאים שלמים.

שוב צנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט המכיל אברונים משוחררים, והשהה מחדש את הגרעינים במאגר שטיפה.

סנן כדי להסיר כל פסולת, צנטריפוגה והסר את הסופרנטנט.

הציגו כתם DNA פלואורסצנטי כדי לסמן את כל הגרעינים ונוגדנים מצומדים פלואורופור שנקשרים לאנטיגן הגרעיני העצבי, או NeuN, המסמן את גרעיני הנוירונים.

באמצעות מיון גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות, זהה אגרגטים בעלי עוצמת פלואורסצנטיות גבוהה יותר של כתמי DNA ותכונות פיזור גבוהות יותר, המפרידים את הגרעינים הבודדים.

לנתח את הגרעינים הבודדים, להפריד את הגרעינים העצביים החיוביים ל-NeuN ולבודד את הגרעינים השליליים של NeuN השייכים לגליה ולתאי הגזע.

הומוגניזציה של הרקמה עם 10 משיכות של עלי A רופף, ואחריו 15 משיכות של עלי B הדוק. העבירו את ההומוגנאט לצינור מקורר מראש של 15 מיליליטר. שוטפים את ההומוגנייזר של Dounce עם 1 מיליליטר HB קר, ומשלבים אותו עם אותו צינור.

הוסף 3 מיליליטר HB לצינור של 15 מיליליטר, ודגר במשך 5 דקות על קרח. מערבבים את תרחיף הגרעינים הזה פעמיים על ידי היפוך הצינור בעדינות. בעזרת 0.5 מיליליטר HB, הרטיבו מראש את מכסה המסננת של 70 מיקרומטר המונח על מבחנה של 50 מיליליטר. לאחר מכן, מסננים את תרחיף הגרעינים לפני שטיפת מסננת התאים עם 0.5 מיליליטר HB.

לאחר מכן, הסר את מסננת התאים, וצנטריפוגה את המבחנה בצנטריפוגה של דלי נדנדה ב -500 גרם למשך 5 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט. השעו בעדינות את הגלולה ב -4 מיליליטר HB באמצעות פיפטה P1000.

לאחר חמש דקות של דגירה על קרח, צנטריפוגה את המתלה ב -500 גרם למשך 10 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. השליכו את ה-supernatant והשעו מחדש את הגלולה ב-3 מיליליטר של חומרי כביסה. השתמש ב-0.5 מיליליטר של חומרי כביסה כדי להרטיב מראש מכסה מסננת של 35 מיקרומטר מעל מבחנה של 50 מיליליטר. לאחר מכן, מסננים את תרחיף הגרעינים על ידי פיפטה של 0.5 מיליליטר מתלה בכל פעם באמצעות פיפטה P1000.

לאחר שטיפת מכסה המסננת עם 0.5 מיליליטר של אמצעי כביסה, הניחו את הצינור על קרח. העבירו את המסנן לצינור חדש של 15 מיליליטר, וצנטריפוגה אותו למשך 5 דקות ו -4 מעלות צלזיוס ב -500 גרם. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב -3 מיליליטר של אמצעי כביסה.

חזור על הצנטריפוגה, והשהה מחדש את הגלולה ב-1 מיליליטר של חומר שטיפה עם נוגדן מצומד נגד Neu ו-AlexaFlour488 של העכבר ו-1 מיקרוגרם למיליליטר DAPI. דגרו את התגובה למשך 45 דקות על קרח בחושך.

למיון גרעינים מופעלים פלואורסצנטיים או FANS, העבירו את תרחיף הגרעינים המוכתמים במערכת החיסון למבחנה של 5 מיליליטר, והניחו אותו על קרח עד לתחילת הליך ציטומטריית הזרימה.

מערבולת הדגימות למשך שלוש שניות בעוצמה מתונה לפני הכנסת הצינורות למכשיר ה-FACS.

כדי להשיג את הנתונים מתרחיף גרעיני כתמים, הגדר את השערים בגובה DAPI ואת אזור ה-DAPI כדי לא לכלול את פסולת התא ואת הגרעינים המצטברים. לאחר מכן, הגדר את השערים באזור פיזור צד היומן או SSC ואת אזור הפיזור קדימה או FSC כדי להפריד את הגרעינים הבודדים מהאגרגט או פסולת התא המוכתמים ב-DAPI שנותרו.

לאחר מכן, בודד את האוכלוסייה השלילית ל-NeuNAF488 על ידי הגדרת השערים לאזור האנטי-NeuNAF488 וה-FSC.

לאחר הניתוח, מיין את האוכלוסייה האנטי-שלילית של NeuNAF488 בצינור איסוף של 1.5 מיליליטר מלא ב-50 מיקרוליטר של חומרי כביסה באמצעות אסטרטגיית השער.