תכנות מחדש של גורל התא של תאי נבט נמטודות לתאי עצב

קחו חיידקים מהונדסים גנטית על מצע גידול נמטודות.

החיידקים נושאים פלסמיד עם גן גורם מווסת כרומטין של נמטודה.

המדיום מכיל משרה המפעיל ביטוי של RNA פולימראז טרנסגני מהגנום החיידקי המתעתק את גן הגורם המווסת כרומטין ל-dsRNA.

הוסף זחלי נמטודות טרנסגניות הנושאים גן גורם שעתוק הגורם לגורל נוירון תחת מקדם הלם חום.

עם צריכת חיידקים, ה-dsRNA שנבלע מייצר siRNA המווסת את ביטוי הגורם המווסת כרומטין, ומקל על תכנות מחדש של גורל התא.

דרך תאי הנבט של ההורים, ה-siRNA מועבר לצאצאים.

ויסות מופחת של ביטוי הגורם המווסת כרומטין בתאי נבט הצאצאים, המסומן על ידי פנוטיפ בולט של הפות, מאפשר את תכנות מחדש שלהם.

הפעל הלם חום על הצאצאים, הפעל את מקדם הלם החום ומבטא את גורם השעתוק המעורר גורל נוירונים המפעיל התמיינות עצבית, והופך תאי נבט לנוירונים.

הנוירונים מבטאים חלבון מדווח פלואורסצנטי טרנסגני, המאפשר הדמיה מיקרוסקופית.

העבר ידנית 50 תולעי L4 לכל שכפול ללוחית NGM RNAi. השתמש בחוט פלטינה. ניתן לזהות תולעי L4 על ידי כתם לבן בערך באמצע הדרך לאורך צידי הגחון שלהן. כעת, דגרו על התולעים בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס בחושך למשך כשבעה ימים. ה-IPTG רגיש לאור.

כאשר צאצאי F1 מגיעים לשלבים L3 ו-L4, הפרד אותם מחיות ההורים הגדולות והעבות יותר. בשלב זה, סנן את ה-F1 עבור פנוטיפ הפות הבולט, מה שמצביע על כך שה-RNAi נגד lin-53 הצליח. פעילות ה-RNAi יכולה גם לגרום לקטלניות, שעולה מעל 15 מעלות צלזיוס. כדי להפעיל את G1 ולגרום להמרה של תא נבט לנוירונים בצאצאי F1, הלם את התולעים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך. השתמש באינקובטור מאוורר, מכיוון שהוא מאפשר הלם חום יעיל יותר.

לאחר מכת החום, דגרו צלחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך הלילה בחושך. חשוב להימנע מגרימת ביטוי יתר של Q1 על ידי הלם חום לפני שבעלי החיים מגיעים לאמצע שלב L3. זה יכול להוביל לביטוי של חלבון Q1 ברקמות לא ממוקדות. למחרת, הקימו מקור אור פלואורסצנטי ומסנן GFP כדי לבחון את בעלי החיים עבור פלואורסצנטיות שמקורה בטרנסגנים באזור פלג הגוף האמצעי.