הקמת תרבית תאי גליה מולר המתקבלת מרשתיות עכבר

קחו רשתית עכברים המכילה תאי Müller Glial, או MG, ונוירונים.

מניחים אותם בתמיסת דיסוציאציה עם אנזימי עיכול ודוגרים עם נדנוד עדין כדי להבטיח פיזור אנזימים אחיד.

אנזימים אלה מפרקים את המטריצה החוץ-תאית, ומנתקים תאים בודדים.

שלח את הרשתית למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לשחרר את התאים.

הוסף מעכב כדי לעצור את פעילות האנזים, ואז צנטריפוגה.

השליכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את התאים במדיה המכילה גורם גדילה ספציפי לתאי MG.

מעבירים את התאים לבאר ודוגרים.

עם הזמן, גורם הגדילה בתקשורת מקל על צמיחה והכפלה של תאי MG בעוד שתאי העצב שאינם מתחלקים מתים.

הסר את המדיה. שוטפים עם מאגר מלח.

דגירה עם אנזים עיכול כדי לנתק את התאים מהבאר.

אוספים את התאים בצינור ואז בצנטריפוגה.

השליכו את הסופרנטנט המכיל את תאי העצב המתים.

השעו מחדש את תאי ה-MG במדיה להמשך ניתוח.

הכן תערובת דיסוציאציה של פפאין DNase I כמתואר בכתב היד. כעת, עם פיפטת העברה מוגדלת, הרם את הרשתית. המתן עד שהרשתית תתייצב בתחתית הקצה, ושחרר את הרשתית, ללא HBSS מוגזם, לתוך הצינור המכיל תערובת פפאין DNase I.

לאחר מכן, הניחו את הצינור על אגוז בחממה ודגרו למשך 10 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס ועם 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, נתק את התאים על ידי פיפטה בזהירות למעלה ולמטה עם פיפטה של 1 מיליליטר. לאחר ניתוק התאים, הוסיפו 275 מיקרוליטר של מעכב פרוטאז אובומוקואיד מערכת הדיסוציאציה של הפפאין כדי לנטרל את הפפאין, וערבבו בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.

מכניסים צינורות לצנטריפוגה, ומסובבים בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות בכוח צנטריפוגלי יחסי של 300. הוסף גורם גדילה אפידרמיס לנפח המחושב של מצע הגידול שחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס. הסר את הצינורות בזהירות מהצנטריפוגה.

מבלי לגעת בכדור בתחתית הצינור, הסר את הסופרנטנט בזהירות ובשלמות. כעת, השעו מחדש את גלולת התא עם 500 מיקרוליטר של מדיום גידול בתוספת גורם גדילה אפידרמיס. לאחר מכן, העבירו את מתלה התאים לבאר אחת של צלחת 12 הבארות המסומנת בתווית. שטפו את הצינור עם עוד 500 מיקרוליטר של מדיום הגידול המוסף של גורם הגדילה האפידרמלי, והוסיפו אותו לבאר.

נדנד את צלחת הבאר בזהירות. לאחר מכן, הכניסו את הצלחת לחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם פחמן דו חמצני. התחל בבדיקת מפגש תאים של 90% עד 100%. לאחר מכן, הסר את המדיום והוסף 1 מיליליטר HBSS קר לשטיפת הבאר. נדנד בעדינות את הצלחת והסר HBSS ללא עקבות.

מאוחר יותר, הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסה המכילה טריפסין שחוממה מראש כדי לנתק את התאים מהבאר. מתנדנדים בעדינות, ודוגרים במשך 2 דקות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. לאחר העברת הצלחת מהחממה לארון הבטיחות הביולוגית, שאפו את התמיסה המכילה טריפסין תוך כדי הטיה. מפזרים אותו בזהירות ובאטיות על הבאר מספר פעמים, עד שהתאים מתנתקים לחלוטין.

לאחר מכן, העבירו את תרחיף התאים הזה לצינור סטרילי של 1.5 מיליליטר, והכניסו צינורות לצנטריפוגה. סובב ב-300 פעמים גרם למשך 8 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, והחזיר את הצינורות לארון הבטיחות הביולוגית. הסר את הסופרנטנט מבלי לגעת בגלולה. כעת, השעו בזהירות את כדור התא על ידי הוספת 600 מיקרוליטר של מצע גידול שחומם מראש ופיפטינג למעלה ולמטה כ-30 עד 40 פעמים.