קבלת אוכלוסיות תאים עצביים שונות מהיפוקמפוס של חולדה

קח שברי היפוקמפוס של חולדות מעופשות.

דגירה עם פפאין כדי לעכל את המטריצה החוץ-תאית של הרקמה ולשחרר תאים, כולל נוירונים, אסטרוציטים ומיקרוגליה.

מוסיפים DNase ומערבבים.

לפרק את הרקמה באופן מכני באמצעות פיפטות בקטרים ההולכים ופוחתים כדי לקבל תרחיף של תא בודד. דגירה כדי שה-DNase יפרק את ה-DNA המזהם.

העבירו את המתלה דרך מסננת, הסירו פסולת.

הוסף מאגר המכיל יונים דו-ערכיים כדי לעצור את הפעילות האנזימטית.

צנטריפוגה והסר את הסופרנטנט העשיר באנזימים.

כעת, הוסף חרוזים מגנטיים חוצץ ואנטי מיאלין. דגרו כדי שהחרוזים יקשרו את פסולת המיאלין.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה והסר את הסופרנטנט.

השעו מחדש את התערובת במאגר והעמיסו אותה על עמוד הפרדה מגנטי המכיל כדורים פרומגנטיים הממוקמים בשדה המגנטי של הממיין המגנטי.

השדה המגנטי שומר על פסולת מיאלין קשורה בחרוזים מגנטיים בעמודה בזמן שתאים נטולי מיאלין עוברים דרכו.

שטפו את העמודה עם חיץ ואספו את הזרימה המכילה נוירונים, אסטרוציטים ומיקרוגליה.

התחל את הדיסוציאציה העצבית על ידי שימוש בסכיני גילוח סטריליים כדי לחתוך לקוביות כל דגימה שנאספה מרקמות מוח בוגרות לחתיכות קטנות של 30 עד 400 מיליגרם על מכסה של צלחת תרבית בת שש בארות. לאחר מכן טבלו את הרקמה ב-1 מיליליטר של HBSS נטול סידן ומגנזיום, והשתמשו בפיפטה כדי להעביר את הדגימות לצינורות צנטריפוגה סטריליים של 2 מיליליטר.

לאחר איסוף כל הרקמות, יש לצנטריפוגה את הדגימות ולשאוף את הסופרנטנטים, ולדגור את הדגימות למשך 15 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, תוך היפוך הצינור מספר פעמים כל חמש דקות כדי להשהות מחדש את פיסות הרקמה המיושבות.

בתום הדגירה, הוסף 30 מיקרוליטר של צינור מעורב אנזים טרי שהוכן לכל דגימה, והפוך בעדינות את הצינורות. לאחר מכן, בעזרת פיפטה של פסטר המסומנת 1, נתק כל דגימה עם 30 טריטורציה למעלה ולמטה, תוך הקפדה להימנע מיצירת בועות. דגירה של הדגימות למשך 15 דקות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם היפוך כל חמש דקות, ולאחר מכן דיסוציאציה של הדגימות עם פיפטה פסטר מספר 2, כפי שהודגם זה עתה.

לאחר מכן, עברו לפיפטה מספר 3. חזור על הדיסוציאציה ודגר את הדגימות למשך 10 דקות נוספות באמבט המים, עם היפוך כל חמש דקות. בתום הדגירה, סנן את התרחיפים החד-תאיים דרך מסננות תאים של 80 מיקרון לתוך צינורות פלקון של 15 מיליליטר, שטוף כל מסננת עם 10 מיליליטר HBSS ללא סידן ומגנזיום כדי לעצור את התגובות האנזימטיות. לאחר סינון הדגימה האחרונה, סובבו את הצינורות ושאבו את הסופרנטנטים.

כדי לרוקן את המיאלין מתרחיפי התאים, השעו היטב את הכדורים ב-400 מיקרוליטר של מאגר להסרת מיאלין, והוסיפו את הכמות המתאימה של חרוזי הסרת מיאלין לכל צינור. פיפטו את התמיסות למעלה ולמטה עד שהתאים והחרוזים מעורבבים היטב. לאחר מכן, דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, שטפו כל דגימה ב-5 מיליליטר של מאגר להסרת מיאלין.

בזמן שהתאים מסתובבים, הניחו עמודה אחת לכל דגימה בשדה המגנטי של סדרן מגנטי, והניחו מסנן נקי של 80 מיקרון על גבי כל עמודה. שטפו כל מסנן ועמוד עם 1 מיליליטר של מאגר להסרת מיאלין שלוש פעמים, ואספו את כל הזרימה במיכל פסולת.

לאחר השטיפה האחרונה, הניחו צינורות תחתונים עגולים מפוליסטירן בנפח 5 מיליליטר ישירות מתחת לכל עמודה כדי לאסוף את הפליטה. לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנט מהדגימות, והשעו מחדש את הכדורים ב-500 מיקרוליטר של מאגר להסרת מיאלין.

החל מיד את מתלי התאים על העמודים, ואסף את התאים בצינורות שמתחת. לאחר מכן, שטפו כל מסנן ועמוד 4 פעמים עם 1 מיליליטר של חוצץ להסרת מיאלין בכל כביסה. לאחר השטיפה האחרונה, סובב את התאים ושאף את הסופרנטנטים.