הקמת תרביות תאי גליה מעורבים ראשוניים מחוט השדרה של עכבר

קצרו חוטי שדרה של עכברים וחתכו אותם לשברים.

העבירו את השברים לצינור המכיל אנזים פרוטאוליטי ו-DNase. מערבולת ודגירה.

האנזים מעכל את המטריצה החוץ-תאית של הרקמה, בעוד ש-DNase מפרק את ה-DNA החופשי המזהם.

מערבולת שוב ופיפטה שוב ושוב כדי להשלים דיסוציאציה של רקמות, לקבלת תרחיף חד-תאי.

צנטריפוגה והסר את הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים בתמיסה המכילה DNase, ומעכב פרוטאז ומערבולת. המעכב מנטרל את האנזים.

שכבו תמיסת מעכב טרייה בחלק העליון, צנטריפוגה, והסירו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את התאים באמצעי שיפוע צפיפות, מערבולת ואז צנטריפוגה.

התאים מתיישבים בתחתית, בעוד שפסולת המיאלין נשארת בחלק העליון.

השליכו את הפסולת. שטפו שוב ושוב עם חיץ, צנטריפוגה והסירו את הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים באמצעי גדילה.

צלחת את התאים. המשטח הלא מצופה מקל על חיבור תאי גליה.

הסר את המדיה המבוזבזת והוסף מדיה טרייה כדי לגרום לשגשוג תאי גליה, תוך יצירת תרבית גליה מעורבת.

עובדים במכסה מנוע של תרבית רקמות, מעבירים ארבעה חוטי שדרה של עכברים לצלחת פטרי של HBSS. השתמש במספריים ובמלקחיים סטריליים כדי לחתוך כל אחד מחוטי השדרה לחתיכות קטנות. לאחר מכן, העבירו את החלקים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל תערובת אנזים פפאין DNase. הימנע מהעברת HBSS לתערובת האנזימים מכיוון שהדבר עלול לגרום לירידה בביצועי האנזים.

חיוני שחלקי הרקמה יתעכלו היטב כדי לקבל תרחיף של תא בודד. עם זאת, עיכול יתר יביא לפחות תאים ברי קיימא. כל מעבדה צריכה לבצע בדיקות פיילוט כדי לקבוע את זמן העיכול המדויק על סמך מה שעובד הכי טוב עבור התאים שלהם.

לאחר מכן, מערבל בעדינות את הצינור ולאחר מכן דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה עם טלטול מסלולי במהירות של 150 סיבובים לדקה. לאחר הדגירה, מערבל את הצינור, ולאחר מכן טריטוציה נמרצת של הרקמה באמצעות פיפטה של 5 מיליליטר כדי לקדם דיסוציאציה נוספת. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התא לצינור של 15 מיליליטר, וצנטריפוגה בטמפרטורה של 300 פעמים גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.

במהלך הצנטריפוגה, הוסף 300 מיקרוליטר של תמיסת מעכב אלבומין אובומוקואיד משוחזר ל -2.7 מיליליטר EBSS בצינור סטרילי וערבב היטב. לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטר של תמיסת DNase. לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא במעכב האלבומין הטרי וה-DNase. מערבולת היטב כדי לשבור את גלולת התא.

לאחר מכן, הוסף 3 מיליליטר של תמיסת מעכב אלבומין אובומוקואיד משוחזרת ללא DNase לתרחיף התאים. צנטריפוגה של התאים ב 70 פעמים גרם למשך 6 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסיבוב, הסר את הסופרנטנט המכיל שברי ממברנה, ושמור את הגלולה.

כדי להסיר מיאלין מתאי חוט השדרה המנותקים, ראשית, הוסף בעדינות 8 מיליליטר של מדיום שיפוע בצפיפות 20% בטמפרטורת החדר לתוך הצינור המכיל את כדור התא והמערבולת. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב 800 פעמים גרם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר מבלי להישבר. לאחר הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את שכבת הפסולת העליונה, המכילה בעיקר מיאלין, ואת הסופרנטנט היוצא מהגלולה.

כדי להסיר כל שיפוע צפיפות שנותר, שטפו את התאים על ידי השעיית הגלולה עם 8 מיליליטר cDMEM מדולל ב-HBSS. צנטריפוגה את התאים ב -400 גרם למשך 10 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט ושטוף את התאים עם cDMEM מדולל כמו קודם.

לאחר הסרת הסופרנטנט, ניתן לאחסן את הגלולה על קרח עד לזריעת התאים. לאחר שיהיו מוכנים לציפוי, השעו מחדש את התאים ב-14 מיליליטר של cDMEM בתוספת 2-Mercaptoethanol, והוסיפו 1 מיליליטר של תרחיף התאים לכל באר בצלחת של 12 בארות.

צלחת בארות נוספות שניתן להשתמש בהן כדי לקבוע את מספר התאים הממוצע לבאר, ואת תכולת המיקרוגליה של התרבית. לאחר שהתאים צופו יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 35.9 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. שנה את המדיום ביום הראשון, שהוא היום שאחרי הציפוי.

חלק מהתאים מחוברים לצלחת התרבית, אך הם עדיין עגולים ברובם. ישנם גם תאים צפים רבים ופסולת משמעותית. חזור על שינוי המדיה שלושה עד ארבעה ימים לאחר מכן.