הבחנה בין אבות אוטיים רב-פוטנטיים אלמותיים לנוירונים של גנגליון ספירלי והערכת ההתמיינות

קח צלחת מרובת בארות המכילה כיסויים סטריליים המצופים במצע תרבית תאים.

הציגו אבות אוטיים רב-פוטנטיים אימורטליים, או iMOPs, במדיום התמיינות עצבי

iMOPs הם קודמים לתאי אוזן פנימית שונים, כולל נוירונים של גנגליון ספירלי, או SGNs, המעבירים מידע שמיעתי למוח.

דגירה, מה שמאפשר לתאים להיצמד למצע. המדיום גורם להתמיינות של ה-iMOPs ל-SGNs.

הוסף קיבוע כדי לגרום לקישור צולב של חלבון, שמירה על מורפולוגיה של תאים ותמיסת דטרגנט לחדירה לממברנות התאים.

הציגו מגיב חוסם כדי למנוע תיוג לא ספציפי.

הוסף נוגדנים מצומדים פלואורופור ספציפיים לסמני התמיינות עצביים ודגר, מה שמאפשר לנוגדנים לסמן את ה-SGNs.

שטפו כדי להסיר נוגדנים לא קשורים, והרכיבו את הכיסויים עם אמצעי הרכבה המכיל כתם גרעיני פלואורסצנטי.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, זהה את אותות הנוגדנים כדי לאשר את ההתמיינות של iMOPs ל-SGNs.

ראשית, נקו כיסויי זכוכית עגולים על ידי הנחתם בצלחת סטרילית של 100 מילימטר, וטבילתם באתנול 70%. מערבבים בעדינות את הכיסויים כדי לוודא שהם מכוסים ומשאירים את התבשיל בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את הכיסויים שלוש פעמים ב-PBS סטרילי 1x ולאחר מכן פעם אחת במים סטריליים.

לאחר מכן, הניחו לכיסויים להתייבש על ידי חשיפתם לאור UV בקולט אדים לתרבית רקמות למשך 15 דקות. לשימוש מיידי, הנח כיסוי סטרילי אחד בכל באר של צלחת של 24 בארות, ונער בעדינות את הצלחת כדי להבטיח שכל הכיסויים מונחים שטוחים. לאחר מכן, צפו את הכיסויים על ידי הוספת 0.25 מיליליטר של 1x PBS המכיל 10 מיקרוגרם למיליליטר של פולי-D-ליזין לכל באר.

לאחר שהצלחת דגרה במשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הסר את תמיסת הפולי-D-ליזין ושטוף את הבארות שלוש פעמים עם PBS סטרילי 1x. לאחר שאיבת הנוזל מהכביסה האחרונה, הכניסו 0.25 מיליליטר של 1x PBS המכיל 10 מיקרוגרם למיליליטר למינין לכל אחת מ-24 הבארות. לאחר דגירה של הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, יש לשאוב את תמיסת הלמינין. לאחר מכן, שטפו כל באר עם 1 מיליליטר של 1x PBS שלוש פעמים, אך השאירו את ה-PBS מהשטיפה האחרונה בבארות עד שהתאים מוכנים לציפוי.

כדי להתחיל בהתמיינות עצבית, ספרו את התאים מאוטוספירות מנותקות כפי שתואר קודם לכן ולאחר מכן השעו אותם מחדש במדיום התמיינות עצבי שחומם מראש. המשך על ידי זריעה בין 1 ל-1.5 x 10⁵ תאי iMOP לכל באר של הצלחת המכילה את תלושי הכיסוי המצופים. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני, והחליפו את מדיום ההתמיינות העצבי כל יומיים.

לאחר שבעה ימים, שאפו את המדיום וקבעו את התאים, אותם יש לחבר לכיסויים, על ידי הוספת פורמלדהיד 4% לכל באר והשארתם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר את הפורמלדהיד ושטוף את התאים פעם אחת ב-1x PBS המכיל 0.1% טריטון X-100. לאחר מכן, הסר את מאגר הכביסה והוסף מאגר חוסם המורכב מ-1x PBS המכיל 10% סרום עיזים רגיל ו-0.1% טריטון X-100 לכל באר.

השאירו את התאים למשך שעה בטמפרטורת החדר ולאחר מכן הסירו את הנוזל והחליפו אותו במאגר חוסם המכיל את הדילול המתאים של נוגדן Cdkn1b או Tubb3. לאחר דגירה של לילה ב-4 מעלות צלזיוס, שטפו את התאים פעם אחת עם 1x PBS המכיל 1% טריטון X-100 ולאחר מכן המשיכו עם צביעה חיסונית כפי שתואר קודם לכן. לאחר השלמת הצביעה, בצע שטיפה אחרונה על ידי הוספת 1x PBS לבארות.

כדי להכין אותם לניתוח, הסר את הכיסויים שאליהם מחוברים תאי כתמים מהצלחת בת 24 הבארות והנח אותם על מדיום הרכבה על שקופית זכוכית. לאחר שנתנו למדיום ההרכבה להתייבש למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס, רכשו תמונות אפיפלואורסצנטיות כפי שתואר קודם לכן.