התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח

התחילו עם צלחת מרובת בארות המכילה תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם, או iPSCs, במדיום עם מעכב רו-קינאז, המקדם את הישרדות התאים.

החלף את המדיום במדיום חיוני המכיל חומרים מזינים וגורמי גדילה.

דגירה כדי לאפשר התפשטות והתמיינות של iPSCs לתאים קודמים.

החלף מדיום זה במדיום התמיינות בתוספת גורמי גדילה פיברובלסטים וחומצה רטינואית, ולאחר מכן דגירה.

גורמי הגדילה מקלים על התמיינות תאים קודמים לתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים, בעוד שחומצה רטינואית מקדמת סינתזה של חלבוני צומת הדוקים.

שטפו וטפלו בתאים בתמיסת אנזים-EDTA כדי לנתק את התאים, וליצור תרחיף חד-תאי.

צנטריפוגה לאיסוף התאים והסרת הסופרנטנט. לאחר מכן, השעו מחדש את התאים במדיום התמיינות טרי.

זרע את תרחיף התאים הזה לצלחת מרובת בארות המצופה בחלבוני קולגן והדבקה.

דגירה כדי לאפשר הידבקות תאים, יצירת צמתים הדוקים בין התאים, הדומים לתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח.

כדי לגרום להתמיינות BMEC מ-iPSCs אנושיים, שטפו את תרבית ה-iPSC המשולבת עם DPBS פעם אחת לפני הדגירה של התאים בנפח המתאים של EDTA אנזימטי למשך כחמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

כאשר הושג תרחיף של תא בודד, אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, והשהה מחדש את הגלולה בנפח מתאים של מדיום תאי גזע, בתוספת 10 מעכבי ROCK מיקרו-מולאריים לספירה.

לדלל את התאים ל-1.56 כפול 10 לרביעי תאים לריכוז סנטימטר מעוקב, ולזרוע 2 מיליליטר תאים לבארות בודדות של קרקעית שטוחה של 6 בארות. לאחר 24 שעות בחממת תרבית התאים, החלף את הסופרנטנט בכל באר במדיום E6 והחזיר את הצלחת לחממה למשך ארבעה ימים נוספים.

כדי לטהר את ה-BMECs שמקורם ב-iPSC, יש לצפות את לוחות תת-התרבות בנפח המתאים של תמיסת קולגן IV ופיברונקטין שהוכנה לאחרונה לכל באר, ולדגור על הצלחות למשך שעתיים לפחות ב-37 מעלות צלזיוס.

ביום השישי של ההתמיינות, אספו את התאים על ידי צנטריפוגה, והשעו מחדש את הכדורים בנפח המתאים של מדיום טרי ללא סרום אנדותל אנושי בתוספת B27, גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי וחומצה רטינואית. צלחת את התאים לכל באר של צלחת תחתונה שטוחה 24 בארות מצופה קולגן ופיברונקטין.