בידוד וטיפוח תאי עצב עובריים של אפרוחים במערך מרובה אלקטרודות

קח ביצת עוף מופרית המכילה עובר בשלב מוקדם.

עקרו את הקליפה ופתחו אותה בזהירות.

הסר את העובר. מנתחים ומעבירים את הראש לצלחת תרבות המכילה חיץ. הסר את גלגל העין.

בצע חתך והסר את שכבות העור, וחשוף את המוח הקדמי והמוח האמצעי.

הסר את השכבה הקרומית הפנימית וכלי הדם. לנתח ולהעביר את המוח הקדמי לצלחת תרבית עם מאגר.

חותכים את הרקמה לשברים קטנים יותר ומעבירים אותם לצינור חרוטי. לאחר שהשברים מתייצבים, הסר את המאגר.

הוסף תמיסת אנזים פרוטאוליטית. דגירה כדי לעכל את המטריצה החוץ-תאית של הרקמה ולשחרר נוירונים.

הסר מדיה עשירה באנזימים, שטוף במדיה נוירובזאלית, והסר את כל האנזימים שנותרו.

הוסף מדיה נוירו-בזאלית. נתק מכנית את הרקמה כדי להשיג תרחיף עצבי.

זרעו את הנוירונים הללו על מערכת מערך מרובת אלקטרודות המצופה במטריצה חוץ-תאית. הוסף מדיה נוירו-בזאלית ודגירה.

נוירונים מתחברים ומרחיבים הקרנות, ויוצרים רשת עצבית.

ביום ציפוי הנוירונים, הוציאו בקבוקון של מטריצה חוץ-תאית מהמקפיא של -20 מעלות צלזיוס. מרססים עם 70% אתנול ומניחים על קרח. הקפד להפשיר את המטריצה החוץ-תאית על קרח. אין להפשיר בטמפרטורת החדר, מכיוון שה-ECM מתפלמר מעל 0 מעלות צלזיוס.

עבוד במכסה המנוע BSL-2 כדי לדלל את המטריצה החוץ-תאית ל-25% על ידי הוספת 300 מיקרוליטר של מדיום נוירו-בסיסי קר ל-100 מיקרוליטר. לאחר מכן, השתמש בפיפטה P200 כדי להוסיף 100 מיקרוליטר של תמיסת מטריצה חוץ-תאית של 25% למרכז מערך הרב-אלקטרודות, תוך הקפדה לא לגעת באלקטרודות. הסר מיד את ה-ECM והשאיר סרט דק על פני השטח.

כסו את מערך הרב-אלקטרודות והניחו באינקובטור תרבית הרקמה עד שיהיו מוכנים לצלחת הנוירונים. התחל בבידוד נוירונים של אפרוחים על ידי עיקור הקליפה החיצונית של ביצת E7 עם 70% אתנול. חשוב לשמור על תנאים סטריליים מנקודה זו ואילך. ודא שכל המכשירים מעוקרים עם 70% אתנול והתמיסות סטריליות. זה מועיל להשתמש במכסה מנוע דיסקציה אך אינו הכרחי לחלוטין לדיסקציות, אם הוא מבוצע במהירות.

לאחר מכן, לאחר החזרת העובר ועריפת ראשו, חתכו סביב העיניים והסירו את גלגלי העיניים. לאחר מכן, השתמש במלקחיים עדינים של Dumont מספר 5 ובמספריים קפיציים כדי לבצע חתך בצד הגחון ולהסיר את שכבות העור החיצוניות כדי לחשוף את המוח הקדמי והטקטום האופטי. מקלפים ומסירים את קרום הקליפה בזהירות.

העבירו את המוח הקדמי לצלחת פטרי אחרת המכילה HBS וחתכו אותה לחתיכות קטנות של כ -2 מילימטרים בעזרת מספריים קפיציים. השתמש בפיפטה סטרילית כדי להעביר את חלקי המוח הקדמי לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. לאחר שחתיכות המוח הקדמי שוקעות לתחתית צינור הצנטריפוגה, הסר כמה שיותר HBS.

לאחר מכן, הוסיפו 1 מיליליטר של 0.5% טריפסין-EDTA שחומם מראש ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. השתמש בפיפטה של פסטר כדי להסיר בזהירות את הטריפסין מבלי להפריע לחתיכות הרקמה. הוסף 1 מיליליטר של מדיום נוירו-בסיסי ותן לחתיכות הרקמה לשקוע לתחתית. לאחר הסרת המדיום וחזרה על הכביסה, מוסיפים 2 מיליליטר של מדיום נוירו-בסיסי ומשולש בעדינות עד שלא רואים עוד חתיכות רקמה.

לדלל את התאים המרחפים מ-1 עד 10 עם מדיום נוירו-בסיסי, ולספור תאים ברי קיימא באמצעות צבע כחול טריפן והמוציטומטר. לאחר הספירה, צלחו את התאים הקשורים על מערכי רב-אלקטרודות מצופים ECM בצפיפות של 2,200 תאים למילימטר רבוע.