Surface פלזמה ליתוגרפיה דפוסים של יצירת רשתות Cell
14 ביוני 2011
טכניקה צדדי ליתוגרפיה פלזמה פותחה כדי ליצור דפוסים משטח יציב להדרכת מצורף הסלולר. טכניקה זו יכולה להיות מיושם כדי ליצור רשתות התא כולל אלה המחקות רקמות טבעיות שימש לחקר מספר סוגי תאים שונים.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא ליצור מיקרו-סביבות תאיות כדי לחקור שאלות ביולוגיות הנוגעות להתנהגויות של תאים בודדים ושל קבוצות תאים המתרחשות בממדים של מיקרו וננו. זאת מושג תחילה על ידי תכנון תבניות שיכוונו בסופו של דבר את מיקום התאים. לאחר מכן, תכנונים אלו מועברים למשטחים בעלי תבניות באמצעות פוטוליתוגרפיה, המאפשרת יצירה של תבניות מיגון פלזמה באמצעות ליתוגרפיה רכה.
לבסוף, תבניות מיגון אלו מסודרות כחצובה בתוך צלחת פטרי כדי לאפשר חשיפה סלקטיבית של המשטחים שמתחתן לפלזמה, מה שיותיר תבנית כימית הרגישה לתאים באזורים שמתחת לכל תבנית. ניתן להפיק תוצאות המראות כיצד התנהגות התא תלויה במיקרו-סביבה שלו ובאינטראקציה שלו עם תאים שכנים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח לגבי השפעותיהן של מיקרו-סביבות על התנהגות תאים, כגון כיצד אינטראקציות בין קבוצות של תאים משפיעות על תופעות מסדר גבוה יותר?
וכיצד משפיעים רמזים ננו-סוב-צלולריים על תפקודים כגון נדידה ובריאות והגבהה? ראשית, השתמשו בדבק מהיר כדי להצמיד שקופית עם תבנית לערימה של שקופיות ריקות. לאחר מכן, צרו מכל מנייר אלומיניום שיהיה גדול מעט מערימת השקופיות, ומספיק גדול כדי להכיל 30 grams של poly dimethyl suboxane או PDMS.
הניחו את ערימת השקופיות בתוך המיכל ולאחר מכן שפכו PDMS על ערימת השקופיות כדי ליצור תבנית ראשונית. לאחר מכן, בצעו ניקוון (Degas) ל-PDMS על ידי הנחת המיכל בתוך תא ואקום. פוצצו בועות אוויר שנותרו ב-PDMS על ידי הסרה והחזרה מהירה של אצבע על צינור שסתום היניקה מספר פעמים, כדי לאפשר לאוויר לזרום לתוך התא לזמן קצר.
השסתום נשאר סגור למשך חמש דקות של ניקוז גזים רציף. לאחר מכן, יש להניח ל-PDMS להתבשות בתוך מנדף זרימה נקי בטמפרטורת החדר למשך יום עד יומיים. לאחר ההתבשות, מקלפים את ה-PDMS מהתבנית המקורית (master pattern), ובכך נוצרת תבנית יציקה.
בשלב הבא, שפכו שכבה דקה של 6 g של דבק אפוקסי דו-רכיבי, שערבובו נמשך דקה אחת בלבד, אל תוך התבנית הראשית. בצעו ניתון גזים (Degas) לאפוקסי באופן מיידי באמצעות מספר מחזורי פירוק בועות לפני התקשות האפוקסי. לאחר שהאפוקסי שעבר ניתון גזים הושאר ללא הפרעה למשך שעה אחת, הוא יהיה למחצה cured.
הוסיפו אפוקסי נוסף לתבנית ללא ניקוון אוויר (degassing) כדי לייצר מבנה עבה יותר שיהיה קל יותר לטיפול בשלבים מאוחרים יותר. לאחר מכן, המתינו לאשורת האפוקסי במשך יום עד יומיים. לאחר שאפוקסי התבנית התקשה, הוציאו את האפוקסי מתבנית המאסטר של ה-PDMS ועטפו סרט דביק סביב תבנית האפוקסי כדי ליצור מכל.
ניתן ליצור תבנית עבודה על ידי מזיגת PDMS על תבנית האפוקסי, ביצוע ואקום (degassing) ל-PDMS והקשחת התבנית החדשה למשך יום עד יומיים. לאחר שהתבנית העובדת הוקשחה, קלפו אותה מהאפוקסי ואחסנו את שתיהן בתוך צלחות פטרי במכל פלסטיק אטום בתוך מנף הזרימה (flow hood) כדי לשמור על הניקיון. כדי להכין תבנית לתבנית פני השטח (surface patterning), חתכו מקטעים קטנים מתבנית העבודה באמצעות להב תער והניחו את המקטעים בתוך צלחת פטרי.
מיקומי חלקי התבנית הללו מסומנים בגב צלחת הפטרי באמצעות טוש קבוע, על ידי שרטוט קו מתאר מסביב למקום שבו חלקי התבנית מונחים; צרו תמיכה בצורת חצובה מחלקים אלו והניחו משקולת על החצובה כדי להבטיח מגע מלא (conformal contact) בין התבנית הפעילה לפני השטח של צלחת הפטרי. הביטו בתחתית הצלחת כדי לוודא מיקום תקין, כפי שניתן לראות בנוכחות של תעלות הנראות לעין בלתי מזוינת או באמצעות זכוכית מגדלת קטנה. הכניסו את המכלול לתא פלזמה.
התחל את טיפול הפלזמה לאחר טיפול הפלזמה. הסר את התבנית ואת מערך המשקל והנח את צלחת הפטרי בתוך תא עבודה סטרילי (biosafety cabinet) תחת אור UV למשך 10 דקות לצורך עיקור. אחסן את הצלחת שם עד לזריעת התאים.
דללו את התאי הניסוי הנבחרים במצע התרבית הסטנדרטי שלהם כדי להשיג את רמת ההצפיפות (confluence) הרצויה. לאחר הנחתה על פני השטח של פטריית הפטרי המדומיינת, מזגו שלוש מיליליטר של תמיסת התאים לתוך הפטריה. הדגרירו את פטריית הפטרי המדומיינת בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, 5% carbon dioxide, ו-100% humidity למשך מספר שעות עד מספר ימים כדי לאפשר לתאים להתרכז על התבנית שנוצרה על ידי תא הפלזמה.
את התבנית בודקים באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה. בעת גידול תאי נוירובלסטומה, יש להוסיף 10 µM של רטינואיק אסיד מדי יום עד להשגת דיפרנציאציה של התאים למצב דמוי-נוירון. יש להחליף את מצע גידול התאים הסטנדרטי מדי שלושה עד ארבעה ימים.
תוצאה טיפוסית של יישום טכניקת הליתוגרפיה בפלזמה היא יצירת תבנית של תאים הדומית למבנה שרירותי או טבעי כלשהו. דוגמה לכך ניתן לראות כאן בדמות זו עם נוירונים שהובדלו באמצעות רטינואיקה על תבנית של קווים. וכאן בדמות זו, שבה נוצרו קווים ורשתות של נוירונים, ניתן להשתמש גם בסוגי תאים שאינם נוירונים כפי שניתן לראות בשתי הדמויות הבאות; דמות זו מציגה תאי אנדותל של וריד טביליות אנושי, ודמות זו מציגה תאי שריר שלד C2C12 היוצרים רשתות כפי שניתן לראות כאן.
ניתן לדגמה גם חומרים כגון polylysine כדי להקל על היצמדות של סוגי תאים מסוימים ולשימושים אחרים. בעקבות הליך זה, ניתן לשלב קלטים נוספים כגון מיקרופלואידיקה, דיגום תאים או מניפולציה גנטית של חלבונים ספציפיים כדי לענות על שאלות נוספות, כגון כיצד שילובים של גירויים משפיעים על התנהגות תאים בודדים ועל התנהגות תאית מסדר גבוה יותר?
סקירה כללית
פותחה טכניקה רב-גונית של ליתוגרפיית פלזמה ליצירת תבניות שטח יציבות המכוונות היצמדות תאית. שיטה זו מאפשרת יצירה של רשתות תאים המדמות רקמות טבעיות ומסייעת בחקר סוגי תאים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- מדעי המוח
- ביו-חומרים
רקע
- הבנת התנהגות תאים במימדי מיקרו וננו היא קריטית למחקר ביולוגי.
- מיקרו-סביבות תאיות משפיעות באופן משמעותי על התנהגות תאים בודדים וקבוצות תאים.
- ליתוגרפיית פלזמה מספקת שיטה ליצירת סביבות מבוקרות לחקר התנהגויות אלו.
- בטכניקות קודמות חסרה גמישות ביצירת תבניות עבור סוגי תאים שונים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה ליצירת מיקרו-סביבות תאיות המכוונות את מיקום התאים.
- בחינת האופן שבו מיקרו-סביבות משפיעות על התנהגות תאים ועל אינטראקציות ביניהם.
- חקירת ההשפעות של רמזים בקנה מידה ננומטרי על תפקודי תא כגון נדידה ודיפרנציאציה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- תכנון תבניות להצבת תאים.
- שימוש בפוטוליתוגרפיה ליצירת תבניות למיגון פלזמה.
- החלת טיפול בפלזמה ליצירת דפוסים כימיים על פני השטחים.
- זריעת תאים על פני השטחים המדופסים ותצפית על התנהגותם.
תוצאות עיקריות
- היווצרות מוצלחת של תבניות תאים הדומות למבנים טבעיים.
- הדגמה שלוביה של תאי נוירובלסטומה למצבים דמויי נוירונים.
- תצפית על אינטראקציות בין סוגי תאים שונים על פני שטח בעלי תבניות.
- הדגשת תפקידם של מיקרו-סביבות בהשפעה על התנהגות התאים.
מסקנות
- טכניקת הליתוגרפיית פלזמה יעילה לחקר התנהגות תאים בסביבות מבוקרות.
- ניתן להתאים שיטה זו לסוגי תאים ולשאלות מחקר שונות.
- מחקרים עתידיים יכולים לשלב טכניקות נוספות כדי לחקור לעומק אינטראקציות בין תאים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תבנית פני שטח באמצעות ליתוגרפיית פלסמה מאפשרת הנדסה מדויקת של מיקרו-סביבות תאיים, התומכת במחקרים ברזולוציה גבוהה של התנהגות תאים ואינטראקציות ביניהם. יכולת זו היא קריטית לצמצום סיכונים בהנחות מחקר ראשוניות ולקידום מודלים חיזוי של היווצרות רקמות ואיתות תאי. היציבות של השיטה ותאימותה לסוגי תאים מגוונים ממצבים אותה כפלטפורמה רב-פעמית למחקר תרגומי ולפיתוח מודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה שיטתית של תגובות תאיות לרמזים מיקרו-סביבתיים מוגדרים.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד משתנים כגון נדידה, היצמדות ודיפרנציאציה.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות באמצעות יצירה מבוקרת של רשתות תאים.
- משפר את רמת הביטחון החזויית בגילויים מבוססי מסלולים ופנוטיפים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק מצעים תבניתיים סטנדרטיים וניתנים לשחזור עבור בדיקות כמותיות מבוססות תאים.
- מאפשר הכנה ניתנת להרחבה של משטחים מוכנים לבדיקה עבור סריקת תרכובות.
- תומך בהערכה חסונה של התנהגות תאים תחת אילוצים מרחביים מוגדרים.
- מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה עבור סוגי תאים ותנאי ניסוי מרובים.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- מיישר רשתות תאים in vitro עם ארכיטקטורות רקמה רלוונטיות למחלה לצורך רציפות תרגומית.
- מאפשר מחקרים ארוכי טווח של התמיינות, הסתגלות ואיתות בין-תאי.
- תומך בקידום מודלים פרה-קליניים בהתאמה לסיכון, על ידי אישור מניפולציה נפרדת של סביבות תאיות.
- משפר את גילוי הביומארקרים באמצעות תצפית מבוקרת על אינטראקציות בין תאים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטת ליתוגרפיית הפלסמה הזו משלבת שלבים החל מגילוי ראשוני, דרך פיתוח בדיקות ועד למחקר פרה-קליני, ובכך מאפשרת בדיקה רציפה של היפותזות ותיקוף של מודלים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך במחקרים מונחי-השערה על התנהגות תאים ויצירת רשתות תחת תבניות כימיות מוגדרות.
- סריקה: מספק תוצאים כמותיים וניתנים לשחזור לצורך השוואה של תגובות תאיות למשתנים ניסיוניים.
- אנליטיקה: מספק קריאות בעלות תוכן גבוה עבור מדדי נדידה, היצמדות ודיפרנציאציה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים in vitro למודלים פרה-קליניים על ידי חיקוי מבני רקמה טבעיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה יציבה וביוקומפטיבילית הניתנת להתאמה למספר תוכניות מו"פ ולסוגי תאים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים מבוססי תאים.
- ערך תפעולי: מספק מצעים בעלי תבניות סטנדרטיים, ניתנים להרחבה וניתנים לשחזור עבור תהליכי עבודה מגוונים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) והתקדמות יעילה של תיק הפיתוח מבחינת הון.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום של נכסי גילוי ונכסים פרה-קליניים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בכימיה של פני השטח, פוטוליתוגרפיה וטכניקות לתרבית תאים.
- דורש גישה לתאי פלזמה, מנדפי זרימה נקיים ותשתיות מיקרוסקופיה.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים להבטחת הדירות (reproducibility) בין ניסויים ואתרים שונים.
- ניתן להתאמה למגוון מצעים פולימריים ותואם לסוגי תאים מרובים.
- יציבות התבנית תומכת במחקרים ארוכי טווח, אך עשויה לדרוש אופטימיזציה עבור יישומים ספציפיים.
