Surface פלזמה ליתוגרפיה דפוסים של יצירת רשתות Cell

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ליצור מיקרו-סביבות תאיות כדי לחקור שאלות ביולוגיות הנוגעות להתנהגויות תאים בודדות וקבוצתיות המתרחשות בממדים מיקרו וננומטריים. זה מושג על ידי עיצוב תבניות שבסופו של דבר ינחו את מיקום התאים. לאחר מכן, עיצובים אלה מתורגמים למשטחי דפוס באמצעות פוטוליתוגרפיה, המאפשרת יצירת תבניות מיגון פלזמה באמצעות ליתוגרפיה רכה.

לבסוף, תבניות המיגון הללו מסודרות כחצובה בצלחת פטרי כדי לאפשר חשיפה סלקטיבית של המשטחים הבסיסיים לפלזמה, מה שישאיר דפוס כימי רגיש לתאים על האזורים שמתחת לכל תבנית. ניתן להשיג תוצאות המראות כיצד התנהגות התא תלויה במיקרו-סביבה שלו ובאינטראקציה שלו עם תאים שכנים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי ההשפעות של מיקרו-סביבות על התנהגות התאים, כגון כיצד אינטראקציות בין קבוצות תאים משפיעות על תופעות מסדר גבוה יותר?

וכיצד רמזים ננומטריים תת-תאיים משפיעים על פונקציות כמו נדידת בריאות והתמיינות? ראשית, השתמש בדבק סופר כדי לחבר שקופית דפוס לערימה של שקופיות ריקות. לאחר מכן, צור מיכל של נייר אלומיניום מעט גדול יותר מערימת השקופיות, וגדול מספיק כדי להכיל 30 גרם של פולי דימתיל סובוקסן או PDMS.

הכניסו את ערימת השקופיות למיכל ואז קדחו PDMS מעל ערימת השקופיות כדי ליצור תבנית ראשונית. לאחר מכן הסר את PDMS על ידי הנחת המיכל בתוך תא ואקום. שברו את כל הבועות הקיימות ב-PDMS על ידי הסרה והחלפה מהירה של אצבע מעל צינור שסתום היניקה מספר פעמים כדי לאפשר לאוויר לזרום לתוך החדר.

השסתום סגור למשך חמש דקות של הסרת גז ללא הפרעה. לאחר מכן אפשר ל-PDMS להתרפא במכסה המנוע הנקי בטמפרטורת החדר למשך יום עד יומיים. לאחר הריפוי, ה-PDMS מתקלף מתבנית המאסטר ויוצר תבנית.

לאחר מכן, יוצקים שכבה דקה של שישה גרם של אפוקסי שני חלקים שזה עתה עורבב במשך דקה לתוך תבנית המאסטר. הסר את האפוקסי מיד באמצעות מחזורי שבירת בועות רבים לפני שהאפוקסי מתייצב. לאחר שאפוקסי דגה יורשה לשבת ללא הפרעה במשך שעה, הוא יירפא חלקית.

הוסף עוד אפוקסי לתבנית מבלי להסיר גז כדי לייצר מבנה עבה יותר שיהיה קל יותר לטפל בו בשלבים מאוחרים יותר. לאחר מכן אפשר לאפוקסי להתרפא במשך יום עד יומיים. לאחר ריפוי תבנית האפוקסי, הסר את האפוקסי מתבנית המאסטר PDMS ולאחר מכן עטוף סרט סביב תבנית האפוקסי ליצירת מיכל.

לאחר מכן ניתן ליצור תבנית עבודה על ידי יציקת PDMS על תבנית האפוקסי, הסרת הגז של ה-PDMS וריפוי התבנית החדשה למשך יום עד יומיים. לאחר ריפוי תבנית העבודה, מקלפים את התבנית מהאפוקסי ומאחסנים את שניהם בתוך כלי פטרי במיכל פלסטיק אטום בתוך מכסה המנוע כדי לשמור על הניקיון. להכנת תבנית לעיצוב פני השטח, חותכים חלקים קטנים מתבנית העבודה בעזרת סכין גילוח ומניחים את החלקים בצלחת פטרי.

המיקומים של קטעי התבנית הללו מסומנים בצד האחורי של צלחת הפטרי עם טוש קבוע על ידי יצירת מתאר סביב המקום שבו יושבים חלקי התבנית יוצרים חצובה מהחלקים ומחכים לחצובה כדי להבטיח מגע קונפורמי בין תבנית העבודה למשטח צלחת הפטרי. התבונן בתחתית המנה כדי לאשר מיקום טוב כפי שמעידה נוכחותם של ערוצים שניתן לראות בעין בלתי או בעדשה מגדלת קטנה. הנח את המכלול בתא פלזמה.

התחל טיפול בפלזמה לאחר הטיפול בפלזמה. הסר את סידור התבנית והמשקל והנח את צלחת הפטרי בתוך ארון בטיחות ביולוגית תחת אור UV למשך 10 דקות לעיקור. אחסן שם את המנה עד שהיא זרועה בתאים.

לדלל את תאי הניסוי הנבחרים במצע התרבות הסטנדרטי שלהם כדי להשיג את המפגש הרצוי. כאשר מניחים אותו על משטח צלחת הפטרי, יוצקים שלושה מיליליטר מתמיסת התא לתוך צלחת הפטרי. דגרו על צלחת הפטרי המעוצבת ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, 100% לחות למשך מספר שעות עד מספר ימים כדי לאפשר לתאים להתאסף על התבנית שנוצרה על ידי תא הפלזמה.

הדפוס נבדק באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. בעת גידול תאי נוירובלסטומה, הוסף 10 מיקרומולר של חומצה רטינואית מדי יום עד שנצפה התמיינות תאים למצב דמוי נוירונים. החלף את אמצעי תרבית התאים הסטנדרטי כל שלושה עד ארבעה ימים.

תוצאה אופיינית של יישום טכניקת הליתוגרפיה בפלזמה היא היווצרות דפוס של תאים הדומה למבנה שרירותי או טבעי כלשהו. דוגמה לכך ניתן לראות כאן באיור זה עם נוירונים שהובחנו עם חומצה רטינואית על דפוס של קווים. וכאן באיור הזה שבו נוצרו קווים ורשתות של נוירונים, ניתן להשתמש גם בסוגי תאים אחרים מלבד נוירונים כפי שניתן לראות בשתי האיורים הבאים, איור זה מציג תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי, ואיור זה מראה C שני תאי שריר שלד C 12 היוצרים רשתות כפי שניתן לראות. הנה.

ניתן גם לעצב חומרים כגון פוליליזין כדי להקל על התקשרות של סוגי תאים מסוימים ולשימושים אחרים בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שילוב של תשומות נוספות כגון מיקרופלואידיקה, גישוש תאים או מניפולציה גנטית של חלבונים ספציפיים על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון כיצד שילובים של גירויים משפיעים על סדר גבוה יותר ועל התנהגות תאים בודדים?