יצירת שבב מחסום דם-מוח באמצעות תאים מקדימים שמקורם ב-iPSC

קח שבב מיקרופלואידי עם תעלות מצופות מטריצה המופרדות על ידי קרום נקבובי.

תאי אב עצביים שמקורם ב-iPSC זרעים בערוץ העליון. דגירה להיצמדות תאים, ואז שטוף כדי להסיר את התאים הלא מחוברים.

לאחר מכן, תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח שמקורם ב-iPSC זרעים בערוץ התחתון.

הפוך את השבב ודגר אותו כדי לחבר את תאי האנדותל לצד הממברנה של התעלה התחתונה.

לאחר מכן, הפוך את השבב כדי לחבר תאים לצד התחתון של התעלה, ויוצר מבנה דמוי צינור חד-שכבתי. שטפו את שני הערוצים במדיה ספציפית לתא.

זרימה רציפה של מדיום התמיינות עצבי בערוץ העליון ומדיום תאי אנדותל בערוץ התחתון.

תאי אנדותל מנצלים גורמי גדילה מהמדיום כדי להתבגר ויוצרים צמתים הדוקים הדומים לכלי דם, ויוצרים את צד הדם.

גורמים נוירוטרופיים מניעים את ההתמיינות של תאי אב עצביים לתאי מוח שונים, ויוצרים את צד המוח. תאים אלה מקיימים אינטראקציה עם תאי האנדותל, ויוצרים מחסום דם-מוח על השבב.

כדי להתחיל, הביאו את המנה המכילה את הצ'יפס המוכן לארון הבטיחות הביולוגית. בעזרת פיפטה P200, שטפו בעדינות את שתי התעלות על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של מדיום התמיינות עצבי לכניסה ומשיכת הנוזל מהשקע. הימנע ממגע עם היציאות, שאב בזהירות טיפות מדיה עודפות מפני השטח של השבב.

ערבב בעדינות את תרחיף התאים כדי להבטיח השעיית תאים הומוגנית. כדי לזרוע את תאי האב העצביים שמקורם ב-iPSC לתוך התעלה העליונה כדי ליצור את צד המוח, הוסיפו קצה P200 המכיל 30 עד 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים בריכוז של 1 x 10⁶ תאים למיליליטר לכניסת התעלה העליונה, ושחררו בעדינות את הקצה מהפיפטה.

קח פיפטה P200 ריקה כדי ללחוץ על הבוכנה, הכנס לשקע התעלה העליון ומשוך בזהירות את המתלה החד-תאי דרך הקצה. העבירו את השבב למיקרוסקופ כדי לבדוק את צפיפות הזריעה בהתפלגות הומוגנית של תאים בתוך התעלה העליונה. לאחר אישור צפיפות התאים בכיסוי של 20%, הניחו מיד את השבבים בחממה למשך שעתיים בחום של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, שטפו את התאים שאינם מתחברים על ידי הוספת מדיום התמיינות עצבי טרי לכניסה, ואיגום הנוזל על ידי פיפטה מהיציאה. שמור על התאים בתנאים סטטיים ב-37 מעלות צלזיוס עם החלפת מדיום התמיינות עצבית יומית. לאחר חיבור iNPCs או ביום שלאחר הזריעה, הביאו את המנה המכילה את הצ'יפס המוכן לארון הבטיחות הביולוגית. שוטפים בעדינות את התעלה התחתונה עם 200 מיקרוליטר של מדיום תאי אנדותל.

הימנע ממגע עם היציאות, שאב בזהירות טיפות של עודף מדיום תאי אנדותל מפני השטח של השבב, והקפד להשאיר מדיום בשני הערוצים. ערבב בעדינות את תרחיף התאים כדי להבטיח השעיית תאים הומוגנית. בעזרת פיפטה P200, שאב 30 עד 100 מיקרוליטר של תרחיף תאי אנדותל מיקרו-וסקולרי במוח שמקורו ב-iPSC בריכוז של 14 עד 20 x 10⁶ תאים למיליליטר, והנח את הקצה בכניסת התעלה התחתונה.

הצעד הקריטי ביותר להשגת תכונות מחסום תפקודיות הוא זריעה של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח. חיוני לתאי זרע בצפיפות מתאימה כדי למנוע היווצרות בועות כדי לאמת התפלגות הומוגנית בתוך מעטפת האיבר.

לחץ על הבוכנה על פיפטה P200 עם קצה ריק, הכנס לשקע התעלה התחתון ושחרר לאט את בוכנת הפיפטה כדי למשוך בזהירות את המתלה החד-תאי דרך התעלה התחתונה. שאפו את תרחיף התאים העודף מפני השטח של השבב. הימנע ממגע ישיר עם יציאות הכניסה והיציאה כדי להבטיח שלא נשאב מתלה תאים מהתעלות. העבירו את השבב למיקרוסקופ כדי לבדוק את צפיפות הזריעה.

התעלה התחתונה מלאה בתאים ללא פערים נראים ביניהם. לאחר אישור צפיפות התאים הנכונה, זרע את התאים בשבבים הנותרים. כדי לחבר את התאים לקרום הנקבובי, שנמצא על גבי התעלה התחתונה, הפוך כל שבב ותן להם לנוח בעריסת שבב. הנח מאגר קטן המכיל DPBS סטרילי בתוך צלחת ה-150 מילימטר כדי לספק לחות לתאים.

דגרו את השבבים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כשלוש שעות או עד שהתאים בתעלה התחתונה נצמדו. לאחר שתאי האנדותל המיקרו-וסקולריים במוח שמקורם ב-iPSC התחברו, הפכו את השבבים בחזרה למצב זקוף כדי לאפשר חיבור תאים לחלק התחתון של התעלה התחתונה. 48 שעות לאחר הזריעה של תאי האנדותל המיקרו-וסקולריים במוח שמקורם ב-iPSC, מאזנים את הטמפרטורה של מדיום תאי האנדותל על ידי חימום באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר מכן, הסירו את המדיום על ידי דגירה תחת מערכת סינון מונעת ואקום למשך 15 דקות. לאחר מכן, חטאו את החלק החיצוני של אריזת המודול הנייד והמגשים עם 70% אתנול, נגבו והעבירו אותם לארון הבטיחות הביולוגית. פתח את האריזה והנח את המודולים במגש. כוון אותם עם המאגרים לכיוון החלק האחורי של המגש. פיפטה 3 מיליליטר של המדיה החמה המאוזנת מראש לכל מאגר כניסה. הוסף מדיום תרבית תאי אנדותל למאגר הכניסה של התעלה התחתונה ומדיום התמיינות עצבי למאגר כניסת הערוץ העליון של הערוץ העליון.

לאחר מכן, פיפטה 300 מיקרוליטר של המדיה החמה המאוזנת מראש לכל מאגר יציאה ישירות מעל כל יציאת יציאה. הנח עד 6 מודולים ניידים על כל מגש. הביאו מגשים לחממה, והחליקו לחלוטין לתוך מודול התרבות כשידית המגש פונה כלפי חוץ. בחר והפעל את המחזור הראשי במודול התרבות. סגור את דלת החממה, ואפשר למודול התרבות לטעון את המודולים הניידים למשך כדקה.

מחזור ההכנה הראשונית הושלם כאשר שורת המצב קוראת "מוכן". הסר את המגש ממודול התרבות והביא אותו לארון הבטיחות הביולוגית. בדוק את הצד התחתון של כל מודול נייד בארון הבטיחות הביולוגית כדי לוודא שהמודולים הניידים הוכנו בהצלחה. חפש נוכחות של טיפות קטנות בכל ארבעת היציאות. אם מודול נייד כלשהו אינו מציג טיפות, הפעל מחדש את המחזור הראשי במודולים אלה. אם מדיה כלשהי טפטפה על המגש, מה שקורה לעתים קרובות יותר ליד יציאות היציאה, נקה את המגש עם 70% אתנול.

לאחר מכן, שטפו בעדינות את שני הערוצים של כל שבב עם מדיום תרבית ספציפי לתא מאוזן חם כדי להסיר בועות אפשריות בערוץ, והניחו טיפות קטנות של מדיה בחלק העליון של כל יציאת כניסה ויציאה. הכנס את השבבים עם המנשאים למודולים הניידים, והנח עד שישה על כל מגש. הכנס את המגשים למודול התרבית. תכנת את תנאי תרבית שבב האיברים המתאימים, כגון קצב זרימה ומתיחה במודול התרבית. ברגע שמחזור הוויסות הושלם, שנמשך כשעתיים, מתחילים התנאים המתוכנתים. לאחר מכן, מודול התרבות מתחיל לזרום בתנאי תרבית שבב האיבר שנקבעו מראש.